Em 1998, o Concise Medical Dictionary da Oxford University definiu terapia gênica como sendo "o tratamento dirigido a curar uma doença genética introduzindo genes normais em pacientes que apresentavam genes defeituosos."(1). A primeira aplicação da terapia gênica em humanos ocorreu em 1990, com uma tentativa de tratar os pacientes com imunodeficiência grave secundária à deficiência de adenosina deaminase(2).
Recentemente, o potencial da terapia gênica como uma ferramenta clínica se expandiu. Terapia gênica já não é limitada à substituição de genes defeituosos, mas se tornou um método de introduzir proteínas ou fatores de crescimento individuais em tecidos específicos e células. Embora todas as células contenham os genes para todas as proteínas humanas, células derivadas de um tecido específico expressam apenas algumas dessas proteínas. Com a terapia gênica, é possível levar um gene a determinada célula e esta a expressá-lo conti-nuamente(2).
A terapia gênica vem tendo papel promissor na área de estudo dos tecidos músculo-esqueléticos pela melhor compreensão da ação dos fatores de crescimento, processo de cicatrização e regeneração de tecidos tais como o osso, cartilagem e ligamentos. Tecnologia moderna já permite a produção de proteínas (proteínas recombinantes humanas) para uso terapêutico. Porém, o período de ação de determinada proteína é curto após ser injetada ou cirurgicamente colocada em um tecido. A transferência de genes representa método alternativo para a transferência desses fatores de crescimento para tecidos específicos (figura 1).
A terapia gênica insere o gene que codifica uma proteína que, caso fosse injetada de forma isolada, seria rapidamente degradada. Dessa forma, essa técnica pode resultar em níveis mais altos e mais constantes de produção de uma proteína específica(3-4). Lewthwaite et al descreveram que a injeção de interleucina recombinante (IL-1) em coelhos não inibiu a indução de artrite(5). Porém, usando terapia gênica para transferir a mesma proteína, Makarov et al conseguiram suprimir a gravidade e recidiva da artrite em coelhos(3). A necessidade de utilização de doses de fatores de crescimento tais como a proteína morfogenética óssea (BMP 2) recombinante em ortopedia pode ser muito alta para exercer efeito desejado sem a utilização da terapia gênica(6-9).
A terapia gênica também permite o envio de proteína a células específicas e, quando comparada com métodos de injeção de proteínas habituais, pode melhorar muito a eficácia da terapêutica(10). Além disso, a introdução de genes específicos pode ser um método particularmente bom para expressão de uma proteína a longo prazo. Proteínas como os fatores de crescimento BMP, TGF(11) muitas vezes apresentam efeitos antagônicos(12). Outro exemplo é a produção de proteínas específicas em uma articulação para prevenir artrite ou, no foco de pseudartrose, para tratá-la.
Uma vez escolhida a proteína a ser transferida, a próxima etapa é onde injetá-la. A terapia gênica pode ser dividida em duas grandes subcategorias envolvendo ou células somáticas ou células germinativas. Na terapia gênica em células somáticas toda ação da proteína codificada cessa quando o paciente morre. Na terapia gênica que envolve células germinativas ou células-alvo, que são gametas (espermatozóides ou células-ovo), as alterações serão transferidas às gerações futuras. Todos os estudos clínicos devem conter apenas utilização de células somáticas em terapia gênica.
Há multiplicidade de tecidos a escolher na terapia gênica somática. Assim, uma vez escolhido o tecido-alvo, também há a necessidade da escolha da célula-alvo. Isto é, quando se decide transferir genes que codifiquem a produção de BMP em um tecido ósseo, é necessário escolher quais células receberão os genes (osteoblastos, miócitos ou fibroblastos). Alternativamente, podem-se escolher células não diferenciadas, como células mesenquimais, que se diferenciarão em tecidos específicos. A escolha de qual célula receberá os genes depende também do vetor utilizado.
Após a proteína e a célula-alvo serem identificadas, a próxima etapa é como realmente colocar o gene que codifica uma proteína dentro das células-alvo, isto é, como escolher um vetor para transporte. O método mais comum usado para inserir DNA em uma célula-alvo é utilizando um vírus, o que é denominado transdução. Também há métodos não virais de transferir DNA puro a células, o que é denominado transfecção.
Após a proteína, a célula-alvo e o vetor serem identificados, então deve ser encontrado um método de transferir o vetor ao tecido hospedeiro, de forma a levar o material genético às células-alvo. O vetor pode ser injetado de forma sistêmica em todas as células do corpo ou localmente para um único tecido.
Em função de a terapia gênica poder atuar em células especificas, ela apresenta vantagem sobre alguns outros tratamentos para doenças metastáticas(13-14). Na terapia gênica sistêmica o vetor pode ser injetado diretamente na corrente sanguínea, mas em alguns tecidos pode levar a efeitos colaterais; é, portanto, mais perigosa. Mesmo assim, esse tipo de terapia gênica pode alcançar tecidos pobres em circulação, como cartilagem e menisco.
A forma mais fácil de realizar a terapia gênica local é injetando o vetor em um tecido específico por via direta ou indireta (figura 2). Na abordagem direta o vetor é injetado diretamente no tecido e na indireta as células-alvo são removidas do corpo e expostas ao vetor escolhido in vitro e então reinseridas no corpo. O método direto de terapia gênica é chamado in vivo e o indireto, ex vivo.
A terapia gênica in vivo tem a vantagem de ser mais fácil de implementar do que a terapia gênica indireta e pode ser efetivamente usada em estudos em joelho e tornozelo, músculos esqueléticos, coluna, osso, ligamento cruzado anterior, ligamento colateral medial, menisco, assim como tendões e ligamentos outros(15).
A terapia gênica ex vivo demanda mais tecnologia que o método in vivo, porque as células devem primeiro ser retiradas do paciente para manipulação. Tal técnica tem a vantagem de selecionar células para que especificamente se quer transferir os genes e também testá-las logo após manipulação no sentido de verificar se essas células agora expressam as proteínas que os genes injetados em seu interior codificam. A próxima etapa, então, é reinjetar no corpo essas células que sofreram transfecção com genes específicos.
Terapia gênica ex vivo tem sido descrita em estudos em coluna, cartilagem articular e músculo esquelético de animais e, recentemente, em articulação metacarpofalangiana humana com o uso de células da medula óssea, células-tronco mesenquimais, células osteoprogenitoras derivadas de músculo, fibroblastos, condrócitos e células sinoviais(15).
Outra etapa importante na terapia gênica é a utilização de seqüência de genes (promotores) que vão ativar determinada célula-alvo a decodificar a seqüência de DNA inserido nas células hospedeiras em proteínas. Assim, todas as células carregam genes para a geração de insulina, mas apenas algumas células do organismo a produzem porque apresentam genes promotores para ativar a sua formação em caso de hipoglicemia. Assim, essa seqüência de genes promotores da ativação dos genes, também, em geral, é inserida junto na célula hospedeira para tornar a terapia gênica efetiva. Importante ação de certos promotores virais tem sido descrita em determinados tipos de tecidos, conseguindo, assim, dar maior eficiência ao procedimento. Promotores virais podem ser manipulados em terapia gênica. Infelizmente, podem ser reconhecidos pelo hospedeiro e ser inativados por mecanismos como a metilação, resultando na diminuição da expressão dos genes em semanas ou meses. Atualmente, têm-se estudado e experimentado promotores não virais que resultem em expressão gênica mais constante(15).
Alguns promotores podem ser ligados ou desligados para ativarem ação celular(16). Gossen e Bujard descreveram promotores que foram ativados somente em animais após o uso de tetraciclina em sua dieta e outro promotor que podia ser induzido ou ativado pela radiação por raios X(17). Moutsatsos et al demonstraram que BMP-2 regulado pela tetraciclina (como descrito anteriormente) pode ser usado em experimentos de crescimento ósseo em ratos(18). Esses promotores também podem ser usados para desligar ou inativar a ação celular quando não for mais desejada.
USO DE VETORES NÃO VIRAIS PARA TERAPIA GÊNICA (TRANSFECÇÃO)
Transfecção refere-se ao processo no qual células eucarióticas são capazes de receber DNA estranho ao seu organismo. Muitas formas de transfecção podem ser utilizadas, como expor uma célula-alvo ao DNA puro, usando lipossomos ou pistola de gene. Todos esses métodos não virais estão associados a baixa imunogenicidade e são, portanto, mais seguros do que métodos virais. Entretanto, podem não ser tão efetivos para transporte de genes quanto os métodos virais(15).
DNA puro - A exposição de uma célula-alvo a DNA puro é provavelmente a forma mais segura de transfecção, mas é também o método menos efetivo. Músculos esqueléticos parecem ser particularmente acessíveis à transfecção por DNA puro. Em 1990, Wolff et al descreveram com sucesso a transfecção de músculo esquelético com o uso de injeção de DNA puro(19). A expressão gênica, entretanto, permanece relativamente baixa nesse método e outros procedimentos têm sido utilizados para aumentar a taxa de transfecção.
Um método de aumentar a taxa de transfecção de DNA puro é utilizar uma matriz gene-ativada (MGA), que representa a utilização de um molde com um plasmídeo (figura 4) desejado, que depois é absorvido pelas células vizinhas. Matrizes gene-ativadas foram utilizadas em associação com plasmídeos de BMP-4, com aumento na velocidade de consolidação de fêmur em ratos, que pode ser ainda melhorada com a presença de hormônio da paratiróide. Também osso, tendão, ligamento e músculo foram transfectados com sucesso usando essas matrizes gene-ativadas.
Outra forma de aumentar a transfecção por DNA puro é pelo uso de genes receptor-mediados. Nesse método utilizam-se ligantes ou proteínas de ligação ao DNA puro. As proteínas de ligação são escolhidas pela afinidade a receptores das célulasalvo. O complexo DNA-proteína de ligação funciona como um anticorpo, direcionando o plasmídeo de DNA para as células específicas, as quais promovem a endocitose do DNA puro e aumentam a taxa de transfecção e expressão gênica. Tal transferência gênica receptor-mediada tem sido muito usada para hepatócitos e mostrou ser útil em pesquisas envolvendo músculo.
Lipossomo - Lipossomos são vesículas microscópicas formadas por uma bicamada de fosfolípides análoga à membrana celular. Vetores de lipossomos podem ser sintetizados pela mistura de fosfolípides com água e genes desejados sob condições apropriadas (figura 1). Lipossomos foram utilizados para transferir genes a condrócitos in vitro e foram usados com genes receptor-mediados para lesões osteocondrais em terapia gênica ex vivo(15). Também puderam ser empregados em estudo usando terapia gênica in vivo em tendões de roedores e coelhos e tendões flexores de cães. Em coelhos tal método pôde produzir expressão gênica curta quando injetada na articulação do joelho. Em geral, quando comparados com vetores virais, os lipossomos apresentam eficiência menor com relação à transferência de genes e expressão dos mesmos.
Pistola de genes - Representa método de introdução de material genético para dentro da célula por meio de microprojéteis de DNA através da membrana celular. Os microprojéteis são, em geral, partículas de ouro de aproximadamente 1mm de diâmetro e capazes de penetrar na membrana celular sem causar dano às células. Tal método pôde ser utilizado em experimentos com músculo e cartilagem.
Eletroporação - Na eletroporação uma descarga elétrica aplicada com uma pistola provoca alteração da permeabilidade da membrana plasmática, facilitando a entrada dos genes nas células-alvo(20).
USO DE VETORES VIRAIS PARA TERAPIA GÊNICA (TRANSDUÇÃO)
Vírus podem inserir material genético de forma eficiente em células hospedeiras. Assim, transdução pode ser consideFigura 4 - Utilização do vetor adenoviral na terapia gênica. http:// en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy rada o método mais eficiente para pesquisadores enviarem material genético para células-alvo. Os vetores virais mais usa-dos são os adenovírus, os vírus adenoassociados, herpes-vírus simples e os retrovírus. Antes de o vetor viral ser utilizado na terapia gênica, o vírus é construído de forma a permitir infecção inicial da célula hospedeira sem a capacidade de o mesmo replicar posteriormente dentro dessa célula. Dessa forma, vírus deficiente de replicação não pode escapar da célula-alvo e infectar outras células.
Adenovírus - Os vetores adenovirais usados em terapia gênica foram baseados nos mesmos vírus que causam doenças em humanos. Após um adenovírus infectar uma célula hospedeira, o material genético permanece como um epissomo dentro do núcleo da célula hospedeira, isto é, ele não é incorporado aos cromossomos da célula hospedeira (figura 4).
Adenovírus podem infectar células em divisão ou não com muita eficiência. Atualmente, os adenovírus utilizados podem acomodar grande quantidade de genes desejados (acima de 35Kb). Há muitas desvantagens, entretanto, na utilização de adenovírus em terapia gênica. Em função de o vírus ser epissomal, o epissomo pode ser perdido ou diluído quando a célula infectada se divide. Assim, muitos adenovírus podem per-der-se, mas aqueles que permanecem expressam as proteínas desejadas. Isso também pode levar a resposta imune e destruir células hospedeiras. A resposta imune pode ser imprevisível e acredita-se que pôde levar à morte um paciente que recebeu vetor adenoviral contendo gene para ornitina transcarbamila(15).
Vetores adenovirais têm sido muito estudados em técnicas in vivo e ex vivo envolvendo osso, tendão, cartilagem, menisco, disco intervertebral e músculo esquelético. Entretanto, a expressão persistente dos genes desejados é limitada pela resposta imune hospedeira(15).
Vírus adenoassociado - Representa um vírus DNA não encapsulado que causa certas doenças nos seres humanos. Esse vírus pode ser incorporado no cromossomo de células hospedeiras mantendo a expressão gênica, mesmo com a divisão celular. Originalmente, tais vírus infectavam apenas células em divisão, mas agora também pôde perceber-se infecção de células pós-mitóticas. A principal vantagem desse vírus sobre os adenovírus é a menor imunogenicidade. Entretanto, carregam menos material genético (cerca de 5,2Kb). Os vírus adenoassociados foram utilizados em pesquisas envolvendo músculo esquelético, células sinoviais, cartilagem, tendão e injeção in vivo intra-articular(15).
Vírus herpes-simples - O vírus herpes-simples é grande, permitindo construir um vírus com capacidade para 30Kb de DNA que se deseja utilizar. É altamente infectante em células em divisão ou não. Também pode permanecer latente em células neuronais. Seus problemas envolvem a sua citotoxicidade. O uso desse vírus foi descrito em pesquisas envolvendo injeção in vivo intra-articular, músculo esquelético e tendão patelar.
Retrovírus - Retrovírus são vírus RNA encapsulados que, após infectar as células hospedeiras, transformam RNA em DNA e, então, integram o DNA no genoma da célula hospedeira. Podem infectar apenas células em divisão; portanto, não podem ser utilizados em células pós-mitóticas como condrócitos. A maior vantagem da utilização desses vetores é a baixa imunogenicidade e antigenicidade, o que torna esses vírus os mais utilizados em ensaios clínicos(15).
A principal desvantagem da utilização desses vírus é sua capacidade de desbloquear oncogenes. Assim, em geral, são utilizados em pesquisas ex vivo, em que se podem monitorizar as células antes de reinjetá-las no tecido-alvo. Vetores retrovirais foram utilizadas em pesquisas envolvendo músculo esquelético, cartilagem e tendão, assim como terapia gênica in vivo em articulações de rato(15).
McCormack et al descreveram casos de crianças portadoras de imunodeficiência, tratadas com um vetor retroviral que carreava o gene deficiente IL2RyC. No grupo, nove entre 10 pacientes foram transfectados e melhoraram da imunodeficiência. Entretanto, dois deles desenvolveram uma forma de leucemia - a leucemia de células T. O fato é explicado pela ativação do oncogene LMO2 pela terapia gênica(16).
Os lentivírus são uma subclasse de retrovírus que podem infectar células em divisão ou não, apresentam baixa imunogenicidade quando integrados nas células-alvo e podem ser construídos com 8Kb de material genético. Podem infectar cartilagem articular ou células musculares.
TERAPIA GÊNICA EM DOENÇAS OU TECIDOS ESPECÍFICOS
Artrite reumatóide - A artrite reumatóide representa uma das únicas doenças relacionadas à ortopedia e envolvida em estudos clínicos de terapia gênica. O foco é bloquear os efeitos da IL-1, uma citocina que está envolvida na patogênese da doença. Pode-se reduzir a gravidade da artrite pela injeção intra-articular de proteína que bloqueia o receptor IL-1 em mo-delos animais e em estudos clínicos humanos. Retrovírus puderam ser utilizados para transportar tais proteínas para sinoviócitos, com melhora na gravidade da doença em joelhos humanos ou articulações de animais(15).
Cartilagem articular - A sobrecarga articular e a baixa capacidade regenerativa da cartilagem hialina têm sido importantes fatores para a artrose precoce. Técnicas como microfraturas, transplante de condrócitos e transplante osteocondrais têm sido desenvolvidas no sentido de melhorar a qualidade das lesões da cartilagem. Nenhum método ideal ain-da foi desenvolvido. Fatores de crescimento como BMP-2, bFGF, TGF e IGF 1 têm mostrado efeito positivo em condrócitos.
Muitas pesquisas demonstraram vetores virais usados em genes transportados a condrócitos in vitro. Os condrócitos submetidos à transdução foram mantidos em gel colágeno e outros tecidos. Pôde-se melhorar a qualidade da matriz cartilaginosa com o aumento da síntese de proteoglicanos por células em cultura utilizando terapia gênica para genes que codificam BMP-2, IGF-1 e TGF-B.
Terapia gênica ex vivo usando condrócitos in vitro associando vetores virais ou não virais também foi descrita. Mason et al usaram vetores retrovirais para transduzir célulastronco mesenquimais com gene para BMP-7 e transportar as células para lesões osteocondrais em coelhos, com melhora da lesão(21).
Terapia gênica ex vivo também foi utilizada em mioblastos geneticamente modificados in vitro, que mostraram capacidade de aderir à sinóvia, cápsula articular e expressão de trans-genes por cerca de 30 dias.
Terapia gênica in vivo usando vetores virais e não virais injetados na articulação demonstraram expressão transgênica por oito semanas(15).
Tendões e ligamentos - Vários fatores, tais como IGF, PDGF, VEGF, têm sido associados à cicatrização de ligamentos e tendões. A administração direta de PDGF e IGF a ligamentos lesados pôde melhorar a cicatrização(15). Outras pesquisas mostraram ação de transgenes para essas proteínas de até oito semanas utilizando técnicas ex vivo ou in vivo.
Estudo envolvendo PDGF em tendões patelares de ratos utilizando terapia gênica com vetor lipossomal pôde aumentar síntese de colágeno e angiogênese quatro semanas após injeção. Martinek et al descreveram melhora da integração da reconstrução do ligamento cruzado anterior usando semitendíneo em dupla banda quando utilizada terapia gênica para expressar BMP-2(22).
Disco intervertebral - Estudos mostraram capacidade de fatores como TGF-B em melhorar a síntese de proteoglicanos do disco intervertebral. A transferência de TGF-B para o núcleo pulposo usando vetor adenoviral resultando em 12 semanas de expressão transgênica(15).
Músculos esqueléticos - A pesquisa envolvendo terapia gênica e músculos encontrou algumas barreiras. As células musculares adultas são pós-mitóticas e não podem ser infectadas por alguns tipos de retrovírus, mas sim as células musculares imaturas como mioblastos. Células adultas com características imaturas são encontradas em distrofias musculares.
Outra barreira ao estudo é a lâmina basal das fibras que apresentam poros de 40mm de tamanho e que atuam como barreira a adenovírus, herpes-vírus e retrovírus que apresentam tamanho maior. Algumas técnicas têm sido desenvolvidas para melhorar a infecção. Alguns fatores de crescimento utilizando terapia gênica têm sido estudados utilizando tecido muscular como IGF1 e FGF, mostrando melhora da cicatrização. Takahashi et al(20) obtiveram melhora da cicatrização de lesão muscular em animais utilizando IGF-1 e eletroporação.
Expressão transgênica pode ser obtida no tecido muscular até 19 meses após injeção de material genético em rato.
Terapia gênica ex vivo tem sido utilizada com vetores virais como adenovírus e herpes-vírus, com expressão gênica de até seis meses(15).
Artrodese da coluna - Artrodese da coluna é um dos procedimentos usuais para tratamento de patologias da coluna. Pseudartrose lombar ocorre em cerca de 40% das artrodeses da coluna.
Alden et al demonstraram que terapia gênica utilizando vetor adenovírus e BMP-2 in vivo induziu formação óssea no músculo paravertebral em ratos(23).
Wang et al, utilizando adenovírus contendo BMP-2, obtiveram fusão vertebral em 15 de 15 ratos estudados e diferente de todos os animais-controle(24).
Consolidação óssea - A terapia gênica in vivo com adenovírus contendo BMP-2 induziu a consolidação óssea em vários modelos animais. Entretanto, muitos estudos associam BMP-2 e formação óssea em animais imunodeprimidos. Nos animais imunocompetentes a formação óssea é consideravelmente menor, em função da resposta imune contra o adenovírus.
Em estudos utilizando vetores não virais, sucesso foi obtido na consolidação óssea. Fang et al mostraram ação sinergista na consolidação óssea entre o BMP-4 e o hormônio da paratiróide PTH-1-34 em fêmur de ratos com perda de fragmento ósseo de 5mm. Quando os dois eram utilizados, a consolidação ocorria em quatro semanas, comparada com os controles (consolidação em nove semanas)(25).
Na terapia gênica ex vivo em consolidação óssea, a síntese óssea pode ser obtida apenas pela purificação de células da medula óssea (células-tronco), sem o uso de qualquer fator de crescimento.
Lieberman et al, utilizando terapia gênica ex vivo com vetor adenovírus contendo BMP-2 e transdução para células de medula óssea de ratos, obtiveram preenchimento de defeitos ósseos(26). A análise histomorfométrica revelou osso de qualidade semelhante ao normal em torque e biomecânica(26).
Lee et al demonstraram que o uso de células musculares transduzidas com BMP-2 contendo adenovírus resultou em preenchimento ósseo em ratos e que células musculares podem atuar como células precursoras osteogênicas(27). O uso de células musculares como células-alvo para terapia gênica ex vivo tem vantagens sobre outras células-alvo como as célu-las-tronco mesenquimais, pois as células musculares são de fácil obtenção e algumas têm a capacidade de expressar marcadores de células-tronco e se diferenciar em osso, músculo, tecido endotelial, adiposo e neural.
