1. Livre-Docente, Professor Adjunto Disciplina de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
2. Chefe do Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital Barra D'Or, Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
3. Médico Ortopedista de Clínica Privada, Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
4. Professor Adjunto do Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto de Biologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
Endereço para correspondência: Nelson Elias, Rua Chafic Murad, 148 - Bento Ferreira - 29050-660 - Vitória (ES), Brasil.
E-mail: nelias17@globo.com
Devido aos avanços recentes na procura, processamento e preservação de tecidos humanos, os bancos de tecidos tornaram-se capazes de oferecer diversos tipos de tecidos para transplantes. Tecidos tais como osso, cartilagem, córnea, pele, válvulas cardíacas, vasos sanguíneos, dura-máter, tendões, membranas timpânicas, ossículos do ouvido médio e medula óssea são atualmente transplantados rotineiramente(1).
Sabe-se que, dependendo da lesão tendinosa, nem sempre é possível realizar a sutura término-terminal, sendo necessária a utilização de outro tendão próximo ou substitutos biológicos e sintéticos. No Brasil, Barros Filho et al utilizaram duramáter como substituto tendinoso, em trabalho experimental, e verificaram a possibilidade de ela vir a ser utilizada como enxerto(2).
Vishwakarma et al relataram ausência de reação inflamatória e obtenção de uma articulação estável e com boa amplitude articular utilizando a membrana amniótica para realizar artroplastia de interposição no quadril, em pacientes com tuberculose osteoarticular(3).
Estimulados por esses trabalhos, avaliamos em animais - coelhos - o uso da membrana amniótica humana como eventual substituto de tendões experimentalmente lesados.
MÉTODOS
Utilizamos 60 coelhos albinos da raça Nova Zelândia, machos com dez semanas de vida e peso médio de 1.100 gramas. Foram mantidos no laboratório e sacrificados de acordo com as normas internacionais para eutanásia de animais usados em experimentação científica.
Projeto aprovado pela Comissão de Ética para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes - UERJ no 158/2004 em 17/9/2004.
A membrana amniótica foi obtida da placenta de gestantes saudáveis, imediatamente pós-parto, com o consentimento delas. Após a recepção da placenta, a membrana amniótica era retirada manualmente e lavada com água corrente. Foram feitos moldes com a membrana, que se assemelhavam à espessura do tendão calcaneano, com comprimento médio de 4cm (figura 1).
Os animais foram submetidos à anestesia endovenosa com tionembutal na dose de 3,0mg/kg de peso corporal. A seguir, foram realizadas a tricotomia e a assepsia da pata traseira direita. Após acesso longitudinal de aproximadamente 4cm de extensão, no nível da inserção do tendão calcaneano, foi obtida e exposta a extremidade distal do tendão, a qual foi submetida à secção completa, 1cm e 3cm acima de sua inserção. Em seguida, ressecou-se um segmento tendinoso com 2cm de comprimento, sendo o espaço resultante preenchido pelo molde de membrana aminiótica em 30 coelhos. O enxerto interposto foi suturado a ambos os cotos do tendão com fio mononáilon 3.0 (grupo A) (figura 2). Em outros 30 coelhos, apenas suturamos a pele. Esse grupo serviu como grupo controle (grupo B).
O fechamento da ferida foi feito por planos com fio de algodão 4-0. No pós-operatório os animais foram imobilizados com gesso tipo cruropodálico, com a pata traseira direita em eqüino. Foram criados subgrupos A1, B1, A2, B2, A3 e B3, contando cada subgrupo com dez animais. A imobilização gessada foi retirada no momento do sacrifício de cada subgrupo, realizada com seis, oito e 12 semanas. Durante todo o experimento os animais foram mantidos em gaiolas individuais de 90cm x 45cm x 45cm, com água e ração à vontade.
Os animais foram sacrificados com seis (A1, B1), oito (A2, B2) e 12 (A3, B3) semanas após o procedimento cirúrgico. Todos os tendões calcaneanos da pata traseira direita foram dissecados. Procedeu-se, então, à verificação visual da cicatrização tendinosa e sua retirada para análise microscópica.
A área cicatricial dos tendões foi incluída em parafina após o processamento histológico de rotina (duplo etanol-xilol). Cortes de cinco micrômetros foram feitos utilizando-se o micrótomo American Optical Spencer®.
A avaliação histológica da área cicatricial, incluída em parafina, foi feita em cima de preparados histológicos corados através das seguintes técnicas: 1) hematoxilina-eosina (HE) - para o estudo dos aspectos gerais teciduais e do tipo de infiltrado inflamatório, sendo todos os núcleos celulares corados em azul arroxeado e os citoplasmas corados em tons de rosa; 2) tricrômico de Gomori (TG) - para o estudo do colágeno fibrilar que aparece sob forma de fibras grosseiras coradas em verde (provavelmente dos tipos I e III que predominam no tendão); 3) resorcina-fucsina de Weigert (W) sem oxidação - para o estudo das fibras elásticas mais maduras e imaturas que aparecem sob a forma de fibras finas coradas em marrom, sendo o fundo corado em rosa claro pelo Orange G; 4) Alcian Blue - safranina (ABS) - para o estudo das proteoglicanas ácidas sulfatadas e carboxiladas que aparecem em azul claro a escuro, sendo o fundo corado em rosa claro pela safranina; 5) reação ao ácido periódico-reativo de Shiff (PAS) - para estudo das glicoproteínas neutras estruturais presentes nos tecidos em geral corados em vermelho-grená; 6) picrosirius red (PSR) - para o estudo da trama colágena mais frouxa (vermelho alaranjado) ou densa (vermelho vivo); e 7) imunomarcação com alfa-actina de músculo liso para marcação de miofibroblastos (IM) - células importantes que aparecem durante o processo de remodelação em função das condições locais de oxigenação.
RESULTADOS
Análise macroscópica
Durante a dissecção para a retirada da peça para ser avaliada pela microscopia óptica, nos grupos sacrificados com seis e oito semanas pós-enxerto de membrana amniótica (MA), observam-se áreas de fragilidade ao longo do enxerto, enquanto que nos grupos com sacrifício com 12 semanas foi difícil diferenciar a área do tendão da área do enxerto; encontrou-se o enxerto muito bem incorporado ao tendão em toda sua área, com aspecto de neotendão.
Avaliações microscópicas
Foram estudadas as áreas de transição tendão-membrana.
Subgrupo A1 (seis semanas) - Nos locais da sutura notamos reação inflamatória com formação de cápsula mista, celular e fibrosa (HE) ao redor dos locais de sutura (figura 3), estando a cápsula negativa para miofibroblastos (IM). A IM mostra positividade para músculo liso presente em vasos sanguíneos até metarteríolas e negativa no interior dos nódulos linfóides, nas células intersticiais por entre as células inflamatórias na área de remodelação, na MA e na cápsula. No corpo do tendão próximo à MA ocorreu reação inflamatória intensa com polimorfos e mononucleares, com predominância destes, com raros nódulos ou folículos linfóides (HE).
Na coloração pela TG identificamos feixes tendinosos próprios de tendão entrelaçados com áreas desorganizadas, representando feixes destruídos ou em remodelação, onde visualizamos com mais nitidez a cápsula. Na reação ao PAS observamos positividade fraca nas áreas de vasos e cápsula, demonstrando pouca participação de glicoproteínas neutras no processo. Na coloração pelo Weigert a MA mostrou-se negativa e os feixes tendinosos continham raras fibras elásticas; no entanto, há nítida positividade na parede dos vasos. Na coloração pelo ABS observamos maior quantidade de proteoglicanas nas áreas de remodelação, reforçando participação de componentes amorfos na fase inicial da remodelação (figura 4).
Subgrupo B1 (controle) - Hemorragia na bainha fibrosa, com áreas de proliferação de vasos e muitas células inflamatórias.
Subgrupo A2 (oito semanas) - Os feixes tendinosos eram mistos, organizados em áreas mais distantes e desorganizados na área tendão-membrana, com presença de reação inflamatória. Na técnica de IM há positividade restrita à parede de vasos, que se mostraram mais evidentes e numerosos. Na coloração pelo TG observou-se riqueza de mastócitos próximos aos pontos de sutura, indicando reação alérgica (figura 5) e na coloração pela W não se observam fibras elásticas aumentadas nas áreas de remodelação, demonstrando que essas fibras não têm papel importante nesses casos.
Subgrupo B2 (controle) - Presença de fibroblastos, numerosas células inflamatórias e desorganização celular.
Subgrupo A3 (12 semanas) - Nas colorações pelo HE, TG, ABS e W, os feixes estavam organizados, sem serem observados pontos de sutura ou membrana amniótica. Na coloração pelo ABS notou-se menor quantidade de proteoglicanas ácidas mostrando que a organização fibrosa já avançou (figura 6). Na técnica de IM há positividade para miofibroblastos em parede de vasos, que estão entre os feixes, demonstrando menos vasculogênese que em oito semanas. Há reação inflamatória intensa, com permanência da membrana amniótica em somente um preparado histológico examinado, sendo que os demais mostram total reabsorção da membrana amniótica e reparação do tendão.
Foi usada a coloração PSR nos três grupos para observar qualitativamente a organização e a densidade da trama de colágeno fibrilar, principalmente o tipo I, que é sabidamente o maior integrante do tendão, em campo claro e polarização.
Com seis semanas o colágeno apresentou-se escasso na área entre o tendão e a membrana. Havia áreas com feixes finos e entrelaçados e desorganizados fora da área da membrana amniótica ou da área de sutura. Nas áreas de sutura próximas à junção músculo-tendão, o colágeno apresentou-se formando cápsula fibrosa, dando maior resistência nessa área de fragilidade. Com oito semanas o colágeno mostrou-se desorganizado nas áreas observadas, independentemente de ter ou não sutura. Com 12 semanas, embora a membrana amniótica estivesse presente em algumas poucas áreas de alguns animais, o colágeno se apresentou mais denso, com trama mais compactada em relação aos outros tempos estudados (figura 7).
Há biocompatibilidade (boa evolução) entre os tecidos devido aos seguintes fatos: a) há reorganização dos feixes tendinosos, tornando o tendão enxertado funcional com o passar do tempo; b) há o desaparecimento de reação inflamatória, embora fosse notada a presença de células gigantes de corpo estranho com 12 semanas em um preparado histológico, denotando cronificação do processo nesse animal ou demora na reabsorção da MA; c) não há participação de miofibroblastos nas áreas intersticiais durante o processo de remodelação, que ficaram restritos à parede dos vasos, não provocando contração durante a funcionalidade do tendão; d) há vasculogênese nos preparados histológicos do grupo de oito semanas, que diminui no grupo de 12 semanas, contribuindo para resolução, talvez devido ao poder regenerador, que sabidamente existe em tecidos placentários, mas cujo mecanismo é pouco entendido; e) há desaparecimento dos mastócitos nas áreas de sutura, presentes no grupo de oito semanas, mostrando diminuição da resposta alérgica; f) há presença de proteoglicanas ácidas na etapa inicial de resolução do processo (fibrilogênese) presente em todos os grupos estudados; g) há desaparecimento de áreas de necrose em alguns preparados histológicos, presentes no grupo de seis semanas; h) não há participação importante de fibras elásticas, nem de glicoproteínas neutras, durante o processo.
Subgrupo B3 (controle) - Pouca orientação de fibras colágenas na área da lesão, com presença de células inflamatórias e fibroblastos. Intensa desorganização celular e presença de hiato entre os cotos tendinosos.
DISCUSSÃO
Além de ser uma das lesões traumáticas mais freqüentes, a lesão do tendão calcaneano levanta muitas dúvidas quanto ao tipo de tratamento a ser utilizado(4). O tratamento cirúrgico bem realizado parece combinar duas propriedades: a de prevenir ou minimizar retração e a outra, de obter boa aposição, desde que não haja um hiato muito grande entre os cotos, ou quando a lesão for crônica. Nesses casos, é necessário empregar outros recursos, como a transferência tendinosa, enxertos biológicos ou artificiais.
A aplicação clínica de membrana amniótica humana apresenta interessantes possibilidades e foi assunto de muitos artigos. Davis foi o primeiro a relatar o uso de membrana fetal para substituição da pele(5). Stern e Sabella usaram-na para tratamento de queimaduras e lesão ulcerada de pele(6-7). Ambos relataram ausência de infecção, alivio da dor, taxa acelerada de epitelização. Volkov relatou o uso de membrana amniótica no tratamento de luxação congênita do quadril(8). Vishwakarma et al relataram o uso de membrana amniótica no tratamento da tuberculose do quadril, obtendo excelentes resultados(3). Trabalho recente de Demirkan et al descreve a possibilidade do uso da membrana amniótica no reparo do tendão flexor(9).
Em nosso experimento, foi difícil determinar onde era tendão e onde era o enxerto do ponto de vista macroscópico, principalmente no grupo com 12 semanas, sugerindo a possibilidade da ocorrência de metaplasia, que mais tarde, pela análise histológica, sugere biocompatibilidade. Essa idéia de metaplasia surgiu depois dos estudos de pesquisadores que demonstraram, a partir de experimentos, que o âmnio humano pode induzir a formação de células epiteliais na membrana amniótica(10).
A análise histológica evidenciou que, na sexta semana, o colágeno se mostrou desorganizado, com reação inflamatória presente; na oitava semana do experimento, o colágeno apresentou-se também desorganizado na área tendão-membrana, com vascularização aumentada e aumento das proteoglicanas ácidas. Na 12a semana o colágeno apresentou-se mais denso, com trama mais compacta, além de menor quantidade de proteoglicanas ácidas e menor vasculogênese, mostrando aumento da organização fibrosa. E somente em um preparado histológico havia ainda permanência da membrana amniótica; nos demais, houve absorção da membrana amniótica com reparação do tendão. Isso permite afirmar que neste experimento houve biocompatibilidade entre os tecidos (tendão e membrana amniótica humana).
Não observamos fenômeno de rejeição em nosso experimento; no entanto, mais estudos são necessários para avaliar a resposta imunológica à membrana amniótica. Segundo Boyd et al, as células embrionárias podem ser imunologicamente inertes devido à ausência do antígeno que determina histocompatibilidade(11).
Para Burgeson et al, quando ocorre, a resposta imunológica seria devida ao colágeno da membrana fetal(12). A antigenicidade do âmnio por razão ainda desconhecida parece ser baixa e respostas tipo corpo estranho e rejeição ainda não foram demonstradas(13). No entanto, em nosso experimento, em um preparado histológico, observamos células gigantes de corpo estranho, que não necessariamente significam rejeição.
CONCLUSÃO
A membrana amniótica humana, quando usada em experimento, em animais, mostrou-se eficiente como elemento reparador de lesões tendinosas.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Rui Garcia Marques - Chefe do Laboratório de Cirurgia Experimental - FCM - UERJ, Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia - Hospital Universitário Pedro Ernesto - UERJ.
2. Barros Filho TEP, Guarniero R, Chih CL, Choi PS, Rodrigues CJ. Substituição de tendão por dura-máter: estudo experimental. Rev Bras Ortop. 1986;21(3):97-9.
3. Vishwakarma GK, Khare AK. Amniotic arthroplasty for tuberculosis of the hip. A preliminary clinical study. J Bone Joint Surg Br. 1986;68(1):68-74.
4. Kurtz RC, Almeida AL, Apfel MR, Elias N, Mesquita KC. Cicatrização nas lesões agudas do tendão calcaneano: estudo experimental comparativo entre o tratamento conservador e cirúrgico. Rev Bras Ortop. 1996;31(10):857-61.
5. Davis JS. Skin transplantation; with a review of 550 cases at the Johns Hopkins Hospital. Johns Hopkins Hosp Rep. 1910; 15: 307-96.
6. Stern M. The grafting of preserved amniotic membrane to burned and ulcerated surfaces, substituting skin grafts. J Am Med Assoc. 1913;60:973.
7. Sabella N. Use of the fetal membranes in skin grafting. Med Rec. 1913;83:478-80.
8. Volkov MV. Arthroplasty of joints using amniotic membrane. In: Chapchal G, editor. Arthroplasty of the Hip. 5th International Symposium 1972 in Nijmegen, Netherlands. Stuttgart: George Thieme; 1973.
9. Demirkan F, Colakoglu N, Herek O, Erkula G. The use of amniotic membrane in flexor tendon repair: an experimental model. Arch Orthop Trauma Surg. 2002;122(7):396-9.
10. Sawyer RH, Abbott UK, Trelford JD. Inductive interactions between human dermis and chick chorionic epithelium. Science. 1972;175(21):527-9.
11. Boyd JD, Hamilton WJ. The human placenta. Cambridge: W Heffer & Sons; 1970.
12. Burgeson RE, El Adli FA, Kaitila II, Hollister DW. Fetal membrane collagens: identification of two new collagen alpha chains. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(8):2579-83.
13. Trelford JD, Trelford-Sauder M. The amnion in surgery, past and present. Am J Obstet Gynecol. 1979;134(7):833-45.
