Diferentes modelos de reparação óssea têm sido amplamente estudados em alvéolos dentários(5,7), defeitos nos ossos longos(15,17,18) e, principalmente, na tábua craniana(1-4,9-13,16). Entretanto, modelos experimentais de regeneração óssea, em ossos não membranosos têm sido pouco relatados na literatura(6,14). Schenk(14) estudou a cicatrização de orifícios ósseos na cortical da tíbia de coelhos com perfuração de 0,1mm. Kattagen & Mittelmeier(6) fizeram perfuração de 6mm de diâmetro em côndilos femorais de coelhos. Verificaram que a cavidade foi preenchida, inicialmente, por coágulo sanguíneo que se organizou com tecido de granulação e fibrose. Após duas semanas, o início da regeneração óssea foi visto na periferia do orifício; entretanto, o osso neoformado ficou confinado à periferia e, com a evolução do processo, grande parte da cavidade permaneceu sem osso e preenchida por medula gordurosa.
A finalidade da presente pesquisa foi a de criar um mode-lo biológico para o estudo de regeneração óssea espontânea para determinar como esta ocorre no osso esponjoso metafisário de cães, seu tempo de evolução e a qualidade do tecido regenerado.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 13 cães machos, adultos, do biotério da Unicamp. O peso variou de 7,5kg a 26kg, com média de 15,04 kg e desvio-padrão de 5,157.
Passado o período de quarentena, os animais foram anestesiados com tiopental sódico, intubados com sonda endotraqueal e mantidos com respiração assistida por aparelho*. Em condições assépticas, os lados internos dos fêmures e das tíbias dos membros pélvicos foram expostos, próximos ao joelho, por meio de duas incisões transversas: uma para o fêmur e outra para a tíbia. Expuseram-se as metáfises distais dos fêmures e as proximais das tíbias e, com perfurador elétrico** e broca de diâmetro de 5,55mm, foi feita uma perfuração em cada uma destas regiões, perpendicular ao plano sagital dos ossos. Perfurou-se a cortical medial e a metáfise e respeitou-se a cortical lateral. Fez-se a hemostasia por pinçamento dos vasos sangrantes e tamponamento dos orifícios ósseos com gaze. Parado o sangramento, suturaram-se as incisões cirúrgicas, em um único plano, com fio de náilon cinco zeros. Os animais receberam uma dose de antibiótico*** e foram mantidos em gaiolas. Nos casos em que houve hematoma ou deiscência na ferida cirúrgica, foi aplicada mais uma dose de antibiótico. Foram sacrificados com dois e cinco dias e uma, duas, três, quatro, seis, oito, dez e 12 semanas de pós-operatório. Para tal, foram anestesiados com tiopental sódico e injetado cloreto de potássio a 19,1% por via endovenosa até a parada cardíaca. Nos períodos de duas, quatro e seis semanas foram sacrificados dois cães e nos demais, um. Os joelhos foram retirados através de osteotomias do terço distal da diáfise do fêmur e proximal da tíbia. Com bisturi e pinça, extirpou-se tanto das partes moles quanto possível, mantendo-se, porém, os ligamentos cruzados íntegros até a fase de processamento macroscópico das peças. Estas foram previamente fixadas em formalina a 10% e, posterior-mente, descalcificadas com ácido nítrico a 5%. Foi feita a inclusão em parafina de modo que os cortes histológicos fos-sem perpendiculares à lesão com amostras em diferentes níveis. Foram feitos cortes de 7µ e as lâminas coradas em he-matoxilina-eosina e tricrômio de Masson. A leitura histológica foi realizada em todos os espécimes, avaliando a qualidade da cicatrização das lesões nos diferentes períodos evolutivos.
RESULTADOS
Dos 13 cães, nove evoluíram bem e sem intercorrências. Os quatro restantes mostraram deiscência da sutura e/ou hematoma uni ou bilateral. Como nenhum desses apresentou sinais de infecção clínica ou histológica, foram incluídos na pesquisa.
Os achados histológicos encontrados estão descritos a seguir.
- Segundo dia: verificou-se que a cavidade estava preenchida por sangue.
-Quinto dia (fig. 1): encontrou-se o terço externo da cavidade ocupado por tecido de granulação constituído de células mensequimais, fibroblastos, vasos capilares e, na peri-feria, proliferação óssea imatura e incipiente formada a partir de traves ósseas preexistentes e do próprio estroma (fig. 1, suplemento). Observaram-se, também, traves ósseas preexistentes necróticas e com aposição óssea recente do tipo "trepadeira" (fig. 1, suplemento). O restante da cavidade estava preenchido por coágulo.
- Primeira semana (fig. 2): houve aumento da área de cicatrização, que passou a ocupar cerca dos dois terços externos da cavidade. A proliferação óssea primária tornou-se mais evidente, principalmente na porção mais periférica e apresentou-se com disposição radiada e composta por traves de tecido ósseo imaturo, não lamelar, rico em lacunas com osteócitos. Essas traves mostraram-se margeadas por rima de osteoblastos e dos primeiros osteoclastos (fig. 2, suplemento). No centro, o coágulo apareceu como uma rede de fibrina frouxa.
- Segunda e terceira semanas (fig. 3): nessas duas semanas os achados histológicos foram semelhantes. Observouse maior organização cicatricial do coágulo na parte central da cavidade e este passou a ocupar menor área. A proliferação óssea das traves mais periféricas mostrou-se exuberante, com sinais de maturação, evidenciada pelo arranjo lamelar de suas fibras colágenas, visto por meio da luz polarizada (fig. 3, suplemento). No estroma de permeio, encontraramse vasos capilares congestos e de paredes delgadas.
- Quarta semana (fig. 4): notou-se cicatriz fibrosa colágena na porção central da cavidade. Perifericamente, a maioria das traves ósseas mostrou sinais expressivos de amadurecimento caracterizados pela presença de osso de padrão lamelar, além de certo grau de alargamento. A seu redor, foi observada rima de osteoblastos e osteoclastos ativos. No estroma notou-se a presença dos primeiros adipócitos.
- Sexta semana (fig. 5): observou-se proliferação óssea na parte central da cavidade ocupada por cicatriz colágena. Houve rarefação do tecido ósseo nos dois terços externos da perfuração caracterizado pelo adelgaçamento das traves ósseas e grande distanciamento entre elas, o que faz lembrar um osso osteoporótico. Encontrou-se, também, marcado aumento da medula óssea adiposa com vasos capilares dilatados e focos de hematopoese (fig. 5, suplemento).
- Oitava e décima semanas (fig. 6): as amostras de ambas as semanas mostraram achados histológicos semelhantes. To-da a cavidade foi ocupada por abundante estroma medular adiposo com focos de hematopoese em meio de traves ósseas delgadas de padrão osteoporótico, à semelhança do qua-dro anterior. A atividade osteoclástica permaneceu presente, porém discreta.
- Décima segunda semana (fig. 7): o aspecto histológico observado foi homogêneo. Encontrou-se tecido ósseo, maduro, lamelar, com traves mais espessas em relação ao quadro anterior. Houve dificuldade na delimitação da cavidade cirúrgica que se igualou ao tecido ósseo envolvente.
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A escolha do cão como animal de estudo, o procedimento técnico-cirúrgico aplicado e o período analisado mostraramse adequados para a avaliação histopatológica. Tanto as metáfises das tíbias como as dos fêmures apresentaram achados histológicos semelhantes, nas diversas fases evolutivas.
A cicatrização fez-se de forma centrípeta, ou seja, da peri-feria para o centro da cavidade. Inicialmente, houve organização do hematoma por tecido de granulação, à semelhança do calo fibroso de fratura(8). Observou-se formação de tecido ósseo, quase imediata, já aos cinco dias da realização do furo, com maior expressão na terceira semana e que se completou após a sexta semana.
O tecido ósseo proliferado mostrou-se, inicialmente, de padrão imaturo, não lamelar. Evoluiu com maturação caracterizada pela orientação lamelada do colágeno das traves ósseas, facilmente identificada através da luz polarizada (fig. 3, suplemento).
Associada à proliferação óssea, observou-se atividade osteoclástica a partir da primeira semana e detectável até a décima semana de evolução. Houve proliferação crescente do estroma medular adiposo iniciado na quarta semana, com hematopoese associada a partir da sexta semana.
Na evolução, mais precisamente da sexta à décima semana, o processo de regeneração óssea apresentou uma fase transitória, em que o tecido ósseo tinha aspecto osteoporótico. As traves ósseas mostraram-se delgadas (pela atividade osteoclástica) e com grande distanciamento entre si devido ao crescimento medular adiposo. Ao final de 12 semanas, essas traves ósseas atingiram a espessura e a distribuição semelhantes às do tecido ósseo envolvente, sendo difícil reconhecer o sítio da lesão primária.
Kattagen & Mittelmeier(6), em estudo semelhante ao nos-so, perfuraram a metáfise dos fêmures de coelhos com broca de 6mm. No mesmo período de evolução, não obtiveram regeneração óssea completa. Esta estava presente apenas na porção periférica, com o centro da lesão substituído por medula óssea adiposa. Talvez a explicação para a diferença observada se deva ao fato de termos utilizado outro animal que, eventualmente, tem potencial de regeneração diferente. Além do mais, nossos cães eram de porte maior que os coelhos e a broca utilizada um pouco menor; assim, os orifícios dos nos-sos animais eram relativamente menores.
Diferentes conceitos têm governado as discussões sobre regeneração óssea: a teoria do osteoblasto propõe que um tecido osteogenético leva à reconstituição óssea a partir de osteoblastos do tecido ósseo viável envolvente (Olliver, 1867, apud Kattagen & Mettelmeier(6)). A teoria da indução acredita que a ossificação ocorra a partir de células mesenquimais osteoprogenitoras totipotentes do tecido conjuntivo estromal. Axhausen (1952), apud Kattagen & Mettelmeier(6), comprovou que ambos os caminhos se completam. Esse achado foi também observado no presente estudo, em que pudemos observar a neoformação óssea tanto a partir de traves ósseas periféricas, preexistentes, envolventes à lesão (teoria do osteoblasto - fig. 1, supl. 1), bem como a partir do mesênquima estromal interno (teoria da indução - fig. 1, supl. 2). Em nenhuma das fases examinadas se constatou ossificação endocondral. Isso se deve, provavelmente, à preservação da cortical óssea lateral no procedimento técnico-cirúr-gico realizado. Esse fenômeno também ocorre nos casos de reparação óssea pós-fratura com envolvimento apenas do osso esponjoso, sem comprometimento da cortical(8).
Em conclusão, o modelo de regeneração óssea proposto, utilizando-se de cães, com perfuração de 5,5mm em osso esponjoso (metáfise distal do fêmur ou proximal da tíbia), respeitando a cortical lateral, mostrou preenchimento completo da cavidade por tecido ósseo em 12 semanas de observação, com evidências histológicas de maior expressão nas primeira, terceira, sexta e 12ª semanas de evolução.
Esses achados podem ser úteis na compreensão da regeneração óssea espontânea de ossos esponjosos e também servir como parâmetro na avaliação de regeneração óssea secundária, sob influência de enxertos homólogos ou heterólogos.
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