Introdução
Está bem estabelecido que o trauma musculoesquelético estáassociado a uma importante resposta inflamatória mediadapor um complexo sistema biológico de mediadores químicos.1Tais mecanismos estão presentes nas lesões musculares.2Além da resposta inflamatória local, órgãos distantes estãosujeitos aos efeitos desses mediadores.3A síndrome da res-posta inflamatória sistêmica (SIRS) é uma complicação gravedesse processo.1,4
A síndrome de esmagamento (SE) é a repercussão sistêmicadas lesões musculares, especialmente quando os membrosinferiores são afetados.5O tipo de lesão muscular associadoà SE ocorre por compressão, como na situação de vítimas sobescombros. Classicamente há um extravasamento de mioglo-bina na circulação, com repercussões renais e em muitos casosa insuficiência renal.6Outros mecanismos relacionados coma SE têm sido estudados, com especial interesse na respostainflamatória.7,8
Citoquinas são mediadores químicos estudados nainflamação e na SIRS. Agem como fatores quimiotáxicos paracélulas inflamatórias, como neutrófilos, e são capazes depromover repostas clínicas sistêmicas, como dor e febre.9A produção de citoquinas anti-inflamatórias ocorre simul-taneamente durante o processo e diminui ou até cessa ainflamação.10Atualmente, diversas citoquinas são conhe-cidas. Dentre as mais estudadas, as interleucinas (IL) 1, 6e TNF- (fator de necrose tumotal ) caracterizam-se porestar fortemente associadas ao processo inflamatório e a IL10 caracteriza-se pela função antagônica às anteriores, ouseja, ação anti-inflamatória. A proporção entre a produçãode citoquinas pró e anti-inflamatórias parece determinar agravidade da reposta inflamatória.3
Recentemente desenvolvemos um modelo experimentalpara compressão de membros inferiores de ratos com as carac-terísticas de uma lesão muscular por esmagamento.8Como objetivo de contribuir para a compreensão da fisiopatolo-gia da compressão muscular em nível celular e molecular,investigamos, neste artigo, se as citoquinas plasmáticas estãopresentes em ratos submetidos à compressão muscular dosmembros inferiores em um modelo experimental que simulea lesão muscular por esmagamento.
Material e métodos
Após a aprovação do comitê de ética para pesquisa em ani-mais, ratos Wistar adultos, com 250-300 g, n = 24, foramprivados de comida, com acesso livre a água em um períodode 12 horas antes dos experimentos. Sob anestesia geral(pentobarbital, intraperitoneal, 30 mg/kg e xilazina 2% intra-muscular, 5 mg/kg), os animais foram mantidos em respiraçãoespontânea no início dos experimentos. Após a estabilizaçãoclínica, 24 animais foram randomizados e divididos em qua-tro grupos (n = 6), de acordo com o tempo de sobrevida apósliberação da compressão (uma hora, seis horas e quatro horas)ou grupo controle (n = 6). Uma faixa de borracha elástica (faixade Esmarch) de 10 cm de largura e 80 cm de comprimentofoi firmemente aplicada com 10 voltas sobre ambos os mem-bros inferiores, de forma simultânea, pelo mesmo pesquisador(fig. 1). A pressão produzida pela faixa foi mensurada comvalor de 300 mmHg, com o uso de uma variação do métodode Whitesides, com a faixa ainda aplicada (fig. 2).11Apósuma hora, a faixa foi retirada. Anestesia foi complementadaquando necessário. De acordo com a prévia randomização,a eutanásia foi feita após uma, duas e quatro horas depoisda retirada da faixa. Controles foram mantidos sob aneste-sia geral por quatro horas, sem compressão ou qualquer outroprocedimento. A eutanásia foi feita com pentobarbital intrape-ritoneal (80 mg/kg) e amostras de sangue (2 mL) coletadas porpunção do coração com agulha e seringa. O sangue retiradofoi centrifugado imediatamente (4?C) e o plasma foi conge-lado (-80?C) para posterior análise das citoquinas. O desenhoexperimental desse modelo foi estabelecido e previamenteconduzido por nosso grupo de pesquisa.8
Expressão de interleucinas 1, 6, 10 e TNF-
Amostras de sangue foram coletadas (2 mL) por punçãocardíaca imediatamente antes da eutanásia. Foram centri-fugadas por 10 minutos em 1.000 g (4?C) e o sobrenadante(aproximadamente 1 mL de plasma) foi colocado em tubosplásticos eppendorf a -80?C para análise posterior. A expressãode interleucinas 1, 6 e 10 e do TNF- foi feita de acordocom as instruções do fabricante (PharMingen - OptEia®, BD
Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Inicialmente, os poçosda placa de leitura receberam o anticorpo específico (Bio-tinylated anti-rat IL 1, anti-rat IL 6, anti-rat IL 10 ou TNF-monoclonal antibodies; PharMingen - OptEia®). As placasforam incubadas por 12 horas (4?C). Os poços foram lavadospor cinco vezes com solução salina em tampão fosfato (PBS)com 0,05% Tween-20 (Polyoxyethylene sorbitan monooleate,Sigma®, USA) (solução padrão). Depois, 200 L da soluçãosalina em tampão fosfato (pH = 7,0) com 10% de «soro fetalbovino» foram adicionados nas placas, que foram incubadaspor 30 minutos a 4?C. Na sequência, as placas foram lavadascom a solução padrão. A primeira coluna da placa (oito poços)recebeu 100 L da solução do antígeno (IL 1, IL 6, IL 10 ouTNF-) em diluições crescentes (PharMingen - OptEia®). Aseguir, foram adicionados 100 L de cada uma das amostrasnas células a partir da segunda coluna (a primeira coluna,como descrevemos, foi reservada para a construção da curvapadrão de cada uma das interleucinas estudadas). Cadaamostra foi estudada em duas células contíguas para quepudéssemos trabalhar com a média dos valores obtidos. Operíodo de incubação nessa fase foi de duas horas e seguiu-se,novamente, a lavagem das células (cinco vezes) com a soluçãopadrão. Anticorpos monoclonais ligados à biotina foramadicionados às placas monoclonais (Biotinylated anti-rat,PharMingen - OptEia®). Após incubação por uma hora, ospoços foram novamente lavados com a solução padrão. Nessafase, foram incorporados para cada poço 100 L de HRP (horseradish peroxidase) conjugada a avidina. As placas foram incuba-das por 30 minutos e lavadas sete vezes com a solução padrão.Na fase final, foram adicionados 100 L de tetrametilbenzi-dina e peróxido de hidrogênio. As placas foram incubadas por30 minutos. Resultados finais foram obtidos com espectro-fotometria (onda de 570 nm, para IL 1, IL 6 e IL 10 e onda de450 nm para TNF).
Análise estatística
A estatística foi analisada com o software SigmaStat®(Sig-maStat for Windows Version 1.0, Copyright 1992-1994, JandelCorporation). Foi usado o teste não paramétrico de Kruskal--Wallis (Anova by ranks test) com os resultados descritos coma mediana e o intervalo interquartil. Na sequência, foram fei-tos pós-testes para comparação de pares nos grupos. Para tal,foi usado o teste t de Student-Newman-Keuls. Para compararos pares após o teste de Kruskal-Wallis, foi usado o teste deDunn.
Resultados
O plasma dos animais foi investigado para a presençade interleucinas pró-inflamatórias (IL 1, IL 6 e TNF-)e anti-inflamatórias (IL 10). Não foi detectada, para olimite do método usado, a presença das interleucinas pró--inflamatórias. Ao contrário, a IL 10 foi encontrada em todosos animais estudados e, após um aumento inicial, apresentouuma diminuição progressiva da sua concentração plasmá-tica (fig. 1). As medianas obtidas foram 0,09 pg/mL (0,073-0,17pg/mL) para o controle, 0,142 pg/mL (0,085-0,259 pg/mL) para
uma hora, 0,09 pg/mL (0,061-0,121 pg/mL) para duas horas e0,03 pg/mL (0,020-0,047 pg/mL) para quatro horas (Kruskal--Wallis Analysis of Variance on Ranks). No último período deestudo (quatro horas após a liberação da compressão mus-cular), essa diminuição adquiriu significância estatística emcomparação com o grupo uma hora (teste de Dunn p < 0,05)(fig. 3).
Discussão
Existem diversos modelos experimentais para o estudoda lesão por compressão muscular e síndrome deesmagamento.7,8,12-15Com nosso modelo, os resultadosdemonstraram alterações significantes dos níveis de IL 10após quatro horas da liberação da compressão.
Embora os resultados mais reprodutíveis tenham sidoencontrados em modelos experimentais, ensaios clínicos rela-cionam os níveis de citoquinas plasmáticas e a gravidade depacientes com múltiplas lesões traumáticas.16Recentemente,os modelos de SE têm focado não apenas nos achados clássi-cos da SE, mas também em alterações sistêmicas relacionadascom a resposta inflamatória.7,8Entretanto, dentro do que revi-samos na literatura, não há estudos que relacionem a SE coma produção de interleucinas 1, 6, 10 e do TNF- no plasma,como neste estudo.
Interleucinas são polipeptídeos produzidos por célulasinflamatórias e exercem sua ação local próximo de onde foramproduzidos.17Fibras musculares danificadas podem produzircitoquinas como TNF-, IL 1 e IL 6 (2). Quando há uma grandeprodução das interleucinas, ocorre um extravasamento dessassubstâncias para o plasma. Nessas condições biológicas, algu-mas dessas citoquinas serviriam de gatilho para uma reaçãoinflamatória sistêmica.17
Resultados interessantes indicam que a IL10 tem um papelregulatório importante nas repostas imunológicas e inflama-tórias, pela sua capacidade de inibir a produção de citoquinaspró-inflamatórias por monócitos.18A IL 10 diminui os níveisde inflamação induzida pelo TNF alfa em células endoteliais,como a produção de espécies reativas de oxigênio e adesão deleucócitos ao endotélio.19Não é claro se a IL 10 está ligadaa lesão muscular, mas há alguma evidência de que níveismoderados a elevados de IL 10 inibam a produção de IL 1 eIL 6 em tais condições.20Nossos achados (aumento de IL 10e não identificação de citoquinas inflamatórias) podem serexplicados por essas interações entre a IL 10 e as citoquinasinflamatórias.
Nesse modelo, citoquinas pró-inflamatórias não foramencontradas no plasma após a lesão causada pela compres-são isolada dos membros inferiores de ratos. Na revisãoda literatura, encontramos dados que ajudam a discutir anão detecção dessas substâncias. Há alguma evidência deque a IL 6 seria produzida apenas em músculos contraídosno momento do trauma.2Por causa do efeito da anestesia,no modelo aqui proposto os músculos estariam relaxados nomomento da aplicação da compressão, fato que pode corro-borar os resultados negativos encontrados na produção decitoquinas inflamatórias. Além disso, é possível que variaçõessutis da concentração de IL 1, IL 6 e TNF- não tenhamsido detectadas nesse modelo pelos limites da metodologiaempregada ou mesmo pelos tempos que determinamospara a detecção (uma, duas e quatro horas), pois sabemosque as interleucinas podem ter uma meia-vida de apenasalguns minutos. É importante reforçar que a IL 10 estevepresente uma hora após a liberação da compressão e quehouve uma diminuição progressiva das concentrações plas-máticas ao longo do experimento. Como dito anteriormente,estudos sugerem que a reação inflamatória final depende daresultante entre os mediadores pró e anti-inflamatórios.20Indiretamente, o decréscimo da concentração plasmática deIL 10 poderia estar relacionado com a presença circulantede IL 1, IL 6 e TNF-. Como conclusão, embora a IL 10 seja umacitoquina anti-inflamatória, os níveis encontrados podem serum sinal indireto da presença de interleucinas inflamatóriasnesse modelo de compressão muscular em ratos.
Conclusões
Nosso modelo experimental de lesão muscular por com-pressão (lesão muscular por esmagamento) demonstrou apresença e a variação dos níveis de IL 10 no plasma, com umpico uma hora após a liberação da compressão e diminuiçãodos valores encontrados quatro horas após.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
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