A cartilagem de crescimento relaciona-se anatomicamente com outras estruturas como tendões, apófises, bursas e ligamentos. Estes elementos podem ser afetados principalmente por distensões e esforços repetitivos, dando origem a processos inflamatórios localizados e provocados por sobrecarga local causando apofisites, osteocondrites, tendinites ou bursites.
Quando, na criança, o processo inflamatório localiza-se nas adjacências da cartilagem de crescimento (como freqüentemente acontece), há, entre os fisioterapeutas, consenso de que a aplicação de ultra-som esteja contra-indicada por temeremse danos às células da cartilagem de crescimento. Este conceito tornou-se dogmático, porém suas justificativas têm embasamento predominantemente teórico. Com efeito, há na literatura apenas o trabalho de Wiltink et al.(1), que estudaram o efeito do ultra-som terapêutico pulsado na ossificação endocondral. A investigação foi realizada em cultura de cartilagem e os autores encontraram aumento do crescimento longitudinal por estimulação da zona proliferativa. Entretanto, não há trabalhos para comparação de resultados, sejam clínicos ou experimentais.
O objetivo deste trabalho foi investigar uma possível ação do ultra-som pulsado quando aplicado nas adjacências da cartilagem de crescimento, principalmente do ponto de vista morfológico (macro e microscópico) e funcional.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em 30 coelhas albinas da raça Nova Zelândia, com peso aproximado de 1,0kg, o que corresponde à idade de dois meses(2). Todos os animais receberam aplicação de ultra-som terapêutico na região da cartilagem de crescimento proximal da tíbia direita, segundo técnica a ser descrita, sendo o lado esquerdo mantido como controle. Os métodos de avaliação foram histológicos descritivos e morfométricos.
Os animais foram divididos em dois grupos, sendo o primeiro composto de 20 coelhas e destinado ao estudo do tratamento em curto prazo e com sacrifício três dias após o término do período da aplicação do ultra-som. O segundo grupo, composto de dez coelhas, foi destinado à avaliação tardia do efeito do tratamento, com sacrifício no final do crescimento esquelético do animal.
Técnica de aplicação do ultra-som terapêutico
A região de aplicação do ultra-som foi na face medial da região proximal da perna direita, onde a tíbia é de localização subcutânea e a região é plana e permite bom acoplamento do transdutor. Comparações realizadas com radiografias mostraram que a periferia da cartilagem de crescimento localiza-se nessa região, adjacente à interlinha articular, que é facilmente percebida por palpação e serviu como referencial anatômico.
Previamente, foi realizada tricotomia na região proximal da perna e do joelho direito. Durante as sessões, os animais foram contidos manualmente, para que ficassem calmos e confortáveis. O aparelho de ultra-som utilizado foi do tipo pulsado, marca KLD Avatar II ®, com freqüência de 1MHz, intensidade de 535mW/cm2 (0,5W/cm2), pulso de 2:8 e previamente calibrado. Cada animal foi tratado uma vez ao dia, durante cinco minutos, por dez dias consecutivos, sempre no mesmo período do dia e com o mesmo aparelho. Após o término do tratamento, foi conferida a calibragem do aparelho.
No último dia da aplicação ultra-sônica, foram injetados 75mg/kg/peso de oxitetraciclina (Terramicina®) intraperitonealmente em cada animal(3), com o propósito de marcar a neoformação óssea. As tetraciclinas apresentam a capacidade de incorporar-se definitivamente ao osso neoformado no período em que estiverem em circulação(4).
No primeiro grupo, após três dias da última sessão com o ultra-som, os animais foram sacrificados com dose letal de tionembutal injetada endovenosamente. Em seguida, os membros posteriores foram desarticulados nos quadris e tornozelos e o fêmur e tíbia limpos das partes moles, mantendo-se, apenas, a união pelos ligamentos e cápsula articular do joelho.
No grupo para avaliação tardia os animais não receberam oxitetraciclina e foram sacrificados de forma análoga, no final do crescimento (seis meses de idade).
Avaliação histológica
As tíbias do grupo de 20 animais foram separadas dos fêmures e serradas transversalmente na região diafisária. O segmento proximal foi fixado a uma máquina especial para corte de tecidos duros(4) e seccionado em metades no plano coronal. Da metade anterior foi retirada uma secção óssea de 1,6mm de espessura, paralela à superfície do corte anterior. Este fragmento foi reduzido no comprimento e destinado ao processamento para avaliação da fluorescência óssea.
A metade posterior da tíbia foi aparada e destinada ao estudo histológico com microscopia de luz comum. Foi fixada em solução de Bouin, onde sofreu descalcificação por passagem de corrente elétrica(6). Depois, foi processada de maneira rotineira, fornecendo cortes coronais de seis micrômetros de espessura, incluídos em parafina, corados pela hematoxilina-eosina e pelo tricrômico azul alciano-fucsina, sendo três cortes de seis micrômetros de espessura e consecutivos para cada coloração.
Determinação da área e espessura
Todas as lâminas foram fotografadas em fotomicroscópio Axiophot®, filme ASA 100 e com controle automático do tempo de exposição. Para seleção da área a ser fotografada foi identificada, primeiramente, a região central da cartilagem de crescimento, facilmente localizada por apresentar uma reentrância típica. A partir deste ponto foi selecionada, para a documentação, a área imediatamente adjacente e medial. Esta região foi escolhida para análise por ser aquela que apresenta as camadas celulares mais facilmente identificáveis e com células mais regularmente distribuídas. Foram obtidas cópias fotográficas de tamanho 9 x 12cm, o que produziu aumento final de 75 vezes.
Em cada fotografia, no limite epifisário da cartilagem de crescimento, foi selecionada uma extensão de 4cm que foi marcada centímetro a centímetro para servir como pontos de referência para as medições. Estes pontos foram denominados, da periferia do corte para a região central, L1, L2, L3 e L4. Depois, foram determinados os pontos de separação entre as camadas germinativa, proliferativa e hipertrófica.
Para serem analisadas, as fotografias foram tomadas ao acaso, sendo classificadas por código, de modo a não serem identificadas no momento da avaliação. Cada fotografia foi colocada sobre uma mesa de medição gráfica e, com um cursor, feito o delineamento da região de interesse, conforme o parâmetro a ser analisado, sendo os cálculos fornecidos automaticamente pelo programa Mini Mop-Videoplan®.
Os parâmetros analisados foram: área da cartilagem de crescimento, área de cada camada da cartilagem de crescimento, espessura da cartilagem e de cada camada, correspondendo às distâncias dos pontos correspondentes do lado epifisário até o lado metafisário, nos pontos demarcados.
Análise quantitativa por contagem de pontos
Para avaliar a área ocupada por cada diferente zona da cartilagem de crescimento, foi realizado um estudo quantitativo de imagens pelo método da contagem de pontos. As lâminas foram fotografadas em fotomicroscópio Zeiss 1, filme Tmax Asa 100, objetiva Apo 40 e Optovar 1,25. A placa de crescimento foi fotografada longitudinalmente sempre na direção da diáfise para a epífise. Foram obtidas cópias em papel fotográfico 12 x 18cm, a partir do original (no negativo) de 160 vezes.
Para cada fotomicrografia, que correspondia a cada zona da placa de crescimento, foi avaliada a proporção células/ matriz utilizando para isso uma placa de pontos regulares eqüidistantes contendo 200 pontos(7).
Preliminarmente, foi feita uma avaliação para que a contagem fosse precisa e confiável, concluindo-se que 200 pontos seriam um número adequado para análise. Para a contagem definitiva, as fotos foram escolhidas de maneira aleatória, ignorando-se se o lado era tratado ou não; a placa de pontos regulares foi, então, sobreposta à foto sem posição predeterminada. Foi identificada qual estrutura histológica seria registrada, célula ou matriz, e iniciada a contagem registrando todos os pontos que estivessem sobre as células. Por meio de subtração foi registrado o número de pontos referentes à matriz.
Avaliação pela fluorescência óssea
A metade anterior da epífise das tíbias de coelhos foi destinada à avaliação pela fluorescência óssea. O material foi processado sem descalcificação, inicialmente desidratado e tratado segundo Frost(8) e Volpon(9), resultando espécimes incluídos em acrílico com espessura de 80 a 100 micrômetros.
As lâminas foram examinadas em fotomicroscópio Axiophot® com epiiluminação por luz ultravioleta, conjunto de filtro 9 (Zeiss®), objetiva 5 e aumento de 2,5 vezes. As fotografias foram realizadas em filme preto e branco, ASA 400. Foram obtidas fotografias do tamanho 9 x 12cm, com aumento final de 77 vezes, no filme negativo.
A análise dos achados foi realizada pelas fotografias aten-tando-se para as regiões de fluorescência. O osso neoformado marcado pela tetraciclina fica depositado em uma faixa fluorescente disposta paralelamente à cartilagem de crescimento; o osso interposto entre esta faixa e a cartilagem de crescimento reflete a osteogênese ocorrida entre a injeção e o sacrifício dos animais (crescimento longitudinal).
A cartilagem de crescimento apresenta-se como uma faixa escura, sem fluorescência alguma. A distância entre a cartilagem de crescimento e a faixa fluorescente foi medida em quatro locais delimitados previamente. Os resultados foram somados e calculados os parâmetros estatísticos. A comparação foi feita com o outro lado contralateral do mesmo animal.
Morfometria macroscópica
O grupo constituído de dez animais para avaliação tardia recebeu o mesmo tratamento do grupo anterior, com a diferença de que só foram sacrificados no final do crescimento esquelético, o que acontece por volta da 14ª à 16ª semana de vida(2).
Os fêmures e tíbias foram isolados e mantidos unidos apenas pela cápsula e ligamento do joelho. Os ossos foram radiografados em AP, aos pares. Nas radiografias foi medido o ângulo frontal da tíbia, definido como aquele formado entre a linha que tangencia a superfície articular do planalto tibial e a linha do eixo longitudinal do osso. Foi medido o ângulo localizado no quadrante ínfero-medial.
Após as radiografias, os ossos foram desarticulados e, com um paquímetro digital, realizadas as medidas de comprimento total do osso e da largura máxima das epífises. Depois, as tíbias foram seccionadas transversalmente na epífise na região onde se localizara a placa de crescimento. A superfície cruenta do fragmento proximal foi embebida em tinta nanquim e "carimbada" em uma folha de papel branca, conse-guindo-se um desenho fiel da superfície de corte. Este desenho foi levado para uma mesa digitalizadora e, ponto a ponto, foi demarcado seu contorno. Com o programa Autocad® fo-ram obtidos o perímetro e a área.
Análise estatística
Os parâmetros obtidos com as medidas dos comprimentos dos ossos, área e espessura das camadas e distâncias da faixa de fluorescência foram avaliados pelo teste t pareado de Student. Os dados obtidos com a contagem de pontos foram avaliados pelo teste de Wilcoxon. O nível de significância foi estabelecido em 5%.
RESULTADOS
Avaliação histológica
Em uma visão panorâmica foi avaliado o formato do osso, formato geral da placa epifisária e do núcleo de ossificação. Com maior aumento foi examinado o pericôndrio, osso metafisário, osso do núcleo de ossificação, arranjo celular da cartilagem de crescimento e substância intercelular. Em um maior aumento foi possível avaliar as características das células das diferentes camadas da cartilagem de crescimento e características das células do pericôndrio. A análise histológica qualitativa não evidenciou diferenças morfológicas entre a cartilagem de crescimento do lado tratado e não tratado.
Morfometria microscópica
A tabela 1 compara os dados obtidos com a morfometria dos cortes histológicos das áreas relativas nos lados tratados e não tratados e a tabela 2 apresenta os dados obtidos com as medidas da espessura geral da cartilagem e a espessura de cada camada, isoladamente.
Os resultados da contagem de pontos nas células das difemedidas da espessura geral da cartilagem e a espessura de rentes camadas estão apresentados na tabela 3 e na porção da cada camada, isoladamente. matriz, na tabela 4.
A tabela 5 apresenta as médias aritméticas das distâncias relativas entre a cartilagem de crescimento e a banda fluorescente. A tabela 6 apresenta os valores médios do ângulo frontal da tíbia nos lados tratado e não tratado. O valores de área e perímetro da secção transversal da tíbia estão na tabela 7.
Para todas as tabelas a comparação entre os vários parâmetros não mostrou diferenças estatísticas entre o lado tratado e o controle.
DISCUSSÃO
Em 1987, Dyson(10) publicou um artigo em que registrava a necessidade de mais investigações para o entendimento das reações orgânicas desencadeadas pelo ultra-som terapêutico. Concordamos com essa posição, uma vez que o uso na prática clínica freqüentemente obedece a padrões empíricos.
O temor de que o ultra-som possa ser potencialmente danoso advém da vulnerabilidade da placa de crescimento aos traumatismos e infecções(11,12), pela nobreza de suas funções, i.e., crescimento global e alinhamento do osso longo e, também, pela constatação da ação das ondas ultra-sônicas sobre outros tecidos. Um dos efeitos bem conhecidos do ultra-som é o tér-mico(13), que, além de algumas manifestações menores, pode provocar cavitações por formação de bolhas que ficam intactas por muitos ciclos (cavitação estável) ou entram em colapso violento (cavitação transitória), elevando mais a tempera-tura local(14). O colapso das bolhas libera energia que pode romper ligações moleculares, produzir radicais livres, causar alterações químicas e lesar o tecido adjacente(15).
Assim, esta investigação buscou pesquisar a interferência das ondas ultra-sônicas sobre a atividade da placa de crescimento, colocando-se entre aquelas que buscam pesquisar os efeitos promovidos pelo ultra-som no organismo humano. O coelho foi escolhido como animal de experimentação por apresentar linhagem relativamente pura, com crescimento ósseo bem conhecido e rápido(2) e pelo fácil manuseio em laboratório.
A região proximal da tíbia foi selecionada por ter localização subcutânea, o que garantiu segurança no posicionamento do transdutor, tendo como referência a interlinha articular, facilmente identificável, e pela sua face medial ser plana. A placa epifisária proximal da tíbia foi selecionada como região de estudo, por ser macroscópica e microscopicamente uniforme, o que favoreceu a análise histológica.
Com relação ao nosso material e métodos, concluímos que seria necessária uma analogia, a mais fidedigna possível, do que ocorre na prática clínica. Afinal, o nosso objetivo desde o princípio foi a correlação direta da prática experimental com a clínica, contribuindo, assim, com a evolução das pesquisas dentro da Fisioterapia.
Selecionamos o ultra-som pulsado pelas características de produção de efeitos fisiológicos térmicos, com grande atenuação de processos lesivos. A intensidade selecionada para a estimulação foi o fundo de escala, a quantidade máxima de intensidade oferecida pelo aparelho, atingindo, assim, o nível no qual supostamente ocorressem riscos de danos teciduais(16).
O tempo de cinco minutos é suficiente para gerar a ocorrência de efeitos térmicos e não térmicos(17) para pequenas áreas, como a região medial do terço proximal de tíbia de coelho. Após o sacrifício dos animais, a retirada dos ossos e o processamento do material foi por nós executado, assegurando, assim, o preparo cuidadoso e padronizado.
Nossa análise microscópica foi qualitativa e quantitativa. A análise qualitativa foi avaliada pela histologia com luz comum, procurando alterações nas zonas da placa de crescimento. A análise quantitativa foi realizada pelo estudo morfométrico da placa de crescimento, avaliando sua área geral, espessura, área específica de cada zona da placa de crescimento e um estudo morfométrico quantitativo de contagem de pontos para a formação celular específica de cada camada. A função mais nobre da cartilagem de crescimento é exatamente o crescimento ósseo que ocorre de maneira longitudinal e resulta da multiplicação e diferenciação das células cartilaginosas. Assim, pareceu-nos que o aspecto e parâmetros morfológicos micro e macroscópicos do disco epifisário pudessem refletir algum dano causado pelo ultra-som. Por outro lado, com a técnica da fluorescência, foi possível avaliar funcionalmente a neoformação óssea.
Sentimos necessidade de incluir um subgrupo adicional para ser seguido até o final do crescimento, pois sabe-se, da clínica, que algumas manifestações de lesão da cartilagem de crescimento só podem ficar caracterizadas na época da maturação esquelética. Todos os nossos resultados não mostraram diferença alguma que pudesse refletir alterações provocadas pelo ultra-som na cartilagem de crescimento. De certa forma, nos-sos resultados contrapõem-se àqueles obtidos por Wiltink et (11), que identificaram um efeito positivo do ultra-som pulsado em cultura de cartilagem, no sentido de promover o comprimento das células proliferativas (aumentando o tamanho desta zona). Cremos que seja difícil a comparação dos resultados dos dois trabalhos. Primeiro, os autores mencionados trabalharam com cultura de células, o que pode não refletir exatamente o comportamento das mesmas células quando participantes do osso in vivo. Segundo, os mesmos autores avaliaram os resultados em curto período de tempo, o que não significa que os efeitos obtidos sejam duradouros. No entanto, identificamos uma crítica à nossa metodologia. Apesar de termos estabelecido os parâmetros de estimulação no aparelho, não foi possível qualificar ou quantificar a energia ultrasônica recebida no disco epifisário. Entretanto, levando em consideração que esta é a situação que se tem na prática clínica, cremos não haver invalidação dos nossos resultados.
Os resultados apresentados na tabela 1, em que analisamos a área global e área por camadas, mostraram números próximos que, analisados estatisticamente, não apresentaram valores significativamente diferentes. Dando seqüência à análise de nossos resultados, a tabela 2, que apresenta a espessura global e de camadas, também não mostrou diferença significativa e assim sucessivamente, para as outras tabelas.
Quando analisados os dados da contagem de pontos para as células da placa de crescimento, deparamo-nos com números que poderiam sugerir diferença; no entanto, quando levados para a análise estatística com o teste de Wilcoxon, novamente a diferença não foi significante.
Em resumo, nossos resultados, quer macro ou microscópicos, quer recentes ou obtidos no final do crescimento, levam a uma única conclusão: não houve indício de que o ultra-som, na dose e técnicas empregadas, tenha provocado alguma alteração transitória ou permanente na cartilagem de crescimento.
Os resultados histológicos nos deram sinais de que as temidas alterações provavelmente não ocorreram. Contudo, isso não exclui a necessidade de um aprofundamento na investigação sobre os efeitos do ultra-som na cartilagem de crescimento. Um prosseguimento deste estudo poderia ser realizado com a avaliação cromossômica após a aplicação do ultra-som, como Haddad(18) realizou para o ultra-som de baixa intensidade aplicado em testículos de ratos. Esta é uma proposta para investigação futura.
CONCLUSÃO
Sob as condições desta pesquisa, a aplicação do ultra-som não provocou alterações morfológicas ou funcionais da cartilagem de crescimento.
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