1. Doutorando do curso Biologia Funcional e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP - Campinas (SP), Brasil.
2. Professor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
3. Cirurgião-Dentista graduado na Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
4. Doutorando do curso Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
5. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
6. Professor Associado do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
7. Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense - UFF - Professor Visitante da Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - USP - Bauru (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense-UFF, Outeiro de São João Baptista, s/n, Campus do Valonguinho, Centro - 24020-150 - Niteroi (RJ) - Brasil. Tel.: (21) 2629-2324, fax: (21) 3701-1617. E-mail: jmgranjeiro@vm.uff.br
O osso é constituído por um tecido conjuntivo altamente especializado, vascularizado e mineralizado, que possui funções fisiológicas e homeostáticas no organismo(1). O tecido ósseo, quando lesado, possui alta capacidade de regeneração espontânea, mas em casos de grandes perdas ósseas essa capacidade não é suficiente para repará-lo adequadamente(2). Nesses casos, é necessária a utilização de enxerto para auxiliar na regeneração morfofuncional do tecido ósseo na região. Apesar de os enxertos ósseos autógenos serem amplamente aceitos como padrão para o tratamento desses defeitos, materiais de enxerto alógenos, xenógenos e sintéticos têm sido amplamente estudados e propostos como alternativas interessantes ao osso autógeno(2-5).
O enxerto de osso autógeno é o tratamento mais indicado, pois apresenta boas propriedades biológicas, como osteogênese, osteoindução e osteocondução. Mas vários inconvenientes ligados a sua utilização, como necessidade de segundo sítio cirúrgico, maior período de convalescença, suscetibilidade às infecções e risco de reabsorções ósseas progressivas e constantes, maior morbidade e custo para o sistema de saúde, limitam o seu uso com mais freqüência pelos cirurgiões ortopedistas e dentistas(6-8).
O aloenxerto é produzido com ossos de indivíduos da mesma espécie, obtidos de bancos de ossos e processados de tal maneira a preservar a sua propriedade osteoindutora e osteocondutora; no entanto, deve ser acelularizado. O alto custo de manutenção e de rigoroso controle para impedir a transmissão de doenças e nem sempre a quantidade de tecido disponível em condições ideais suprir as necessidades cirúrgicas e a demanda da população estimulam novas alternativas de en-xerto(9).
Dentre os materiais xenogênicos, os de origem bovina merecem destaque, pois a matéria-prima para sua produção é abundante e seu custo final é acessível à população; são seguros em relação à indução de resposta imune e transmissibilidade de doenças quando do processamento laboratorial ade-quado(10). A desproteinização do osso bovino a temperaturas superiores a 300oC resulta em materiais biocompatíveis e os-teocondutores(11-14).
Atualmente, uma das grandes metas na área médico-odon-tológica mundial é encontrar o carreador ideal para fatores de crescimento ou de indução, como as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), que seja biocompatível e osteocondutor, e que possa ser usado para melhorar a regeneração do tecido ósseo no local do tratamento. Desse modo, vários biomateriais produzidos com osso bovino, devido às suas características biológicas já avaliadas, têm sido sugeridos como candidatos a carreador de moléculas sinalizadoras e células para a bioengenharia tecidual. Apesar da utilização relativamente grande desses enxertos xenogênicos na prática cirúrgica, faltam, ainda, informações relativas às bases moleculares e celulares da ação desses materiais, de forma a permitir a investigação de alternativas para otimizar sua efetividade e segurança.
É consenso que o osso desmineralizado, independente da espécie, contém fatores de crescimento e BMPs(15-16) capazes de induzir a osteogênese, sendo potencial material para auxiliar o reparo ósseo. Uma vez que a idade do tecido pode afetar
o conteúdo desses fatores de crescimento, é pertinente identificar fontes de matriz óssea desmineralizada ricas em fatores osteogênicos. Aliando a biodisponibilidade de animais jovens e o potencial maior conteúdo desses fatores, pretendemos avaliar a resposta tecidual ao implante do osso fetal bovino (FBB) em subcutâneo de ratos.
MÉTODOS
Foram utilizados 40 ratos machos adultos (Rattus norvegicus), 160g, divididos em dois grupos (n = 5): controle (somente os procedimentos cirúrgicos) e teste, implantação do osso fetal bovino (FBB) em bloco (1 x 1 x 1cm), os quais fo-ram sacrificados 10, 20, 30 e 60 dias após o implante do material. A pesquisa foi realizada com a aprovação e segundo as normas recomendadas pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da Faculdade de Odontologia de Bau-ru-USP, seguindo o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Preparo do material
O FBB foi extraído de osso medular de feto bovino obtido no frigorífico local. O material, após ser coletado, é processado mecanicamente e lavado com o objetivo de eliminar remanescentes de tecido, sangue, gordura e outras impurezas. Posteriormente, o material é tratado quimicamente com solução fortemente alcalina e solventes orgânicos a fim de garantir a completa acelularização do tecido, seguindo-se a desmineralização com HCl 0,6M a 4oC, de acordo com Urist(15).
Procedimentos cirúrgicos
Os animais foram anestesiados, por via intramuscular, com 0,5mL/kg de peso de uma mistura de cloridato de cetamina + cloridato de xilazina, na proporção 1:1 (v/v). Realizaram-se tricotomia e assepsia com álcool iodado da pele na região dorsal do animal. Uma incisão reta na pele desses animais no senti-do longitudinal, de aproximadamente 25mm, foi realizada para expor o tecido conjuntivo subcutâneo; em seguida, uma cavidade cirúrgica foi criada por meio de uma tesoura de ponta romba.
O osso fetal bovino em bloco foi colocado na cavidade cirúrgica através de uma pinça reta. Seguiu-se a sutura (fio de seda no 3.0, EthiconTM, Johnson & Johnson, São José dos Campos, Brasil) e assepsia com álcool iodado. No grupo controle o mesmo procedimento cirúrgico foi realizado, mas não houve implantação do material. Por todo o período experimental os animais receberam dieta normal ad libitum composta de ração granulada e água, sendo mantidos em gaiolas com forragem de maravalha.
Decorridos os períodos experimentais de 10, 20, 30 e 60 dias, o tecido reacional foi localizado e removido, seguindo os mesmos procedimentos acima descritos. Em seguida, os animais foram mortos por deslocamento cervical.
Análise microscópica
O tecido reacional obtido de cada animal foi fixado por 24 horas em solução de formalina a 10% em tampão fosfato, lavado em água corrente por cinco horas e processado para inclusão em HistosecTM (Merck). Cortes histológicos com 6µm de espessura foram obtidos e corados com hematoxilina-eosi-na (HE) para avaliação da morfologia e da regularidade superficial do material estudado, assim como da resposta biológica dos tecidos circunjacentes ao material, calculada em função das alterações inflamatórias (presença de edema, alterações vasculares e infiltrado inflamatório) e dos processos reparatórios (grau de fibrosamento, proliferação angioblástica e fibroblástica). A análise semiquantitativa dos tecidos foi realizada utilizando-se escores de 0 a 3, indicando o grau, a saber, au-sente (0), leve (1), moderado (2) e intenso (3), para o infiltrado inflamatório, presença de vasos sanguíneos e fibrosamento. As medianas e desvio-padrão foram analisados utilizando o teste de Kruskal-Wallis e o de comparações múltiplas de Dunn, se p < 0,05.
RESULTADOS
Análise descritiva
Grupo controle
No grupo controle foi observada apenas a regeneração do tecido conjuntivo subcutâneo nos dois primeiros períodos (10 e 20 dias), enquanto nos últimos períodos (30 e 60 dias) foi verificado tecido conjuntivo normal na região com presença de tecido adiposo.
Grupo teste
Período de 10 dias: No período inicial, o FBB estava aparentemente regular, exibindo seu formato original, seus espaços centrais ocupados por coágulo sanguíneo e rede de fibrina. Perifericamente, o implante apresentou-se circundado por tecido conjuntivo rico em células e vasos que invadiram suas cavidades, substituindo o coágulo em reabsorção.
A superfície do FBB mais externa exibiu algumas poucas áreas de absorção, com presença de células mononucleadas e células gigantes multinucleadas (figura 1A). Os antigos canais nutritivos da matriz implantada apresentaram-se preenchidos pelo tecido conjuntivo circundante.
Período de 20 dias: A matriz implantada apresentou-se praticamente íntegra e os espaços internos ocupados por tecido conjuntivo frouxo. Na região central do implante a sua superfície mostrou raras áreas de absorção, com presença de células mononucleadas semelhantes a fibroblastos (figura 1B).
Circundando externamente o implante, havia a presença de tecido conjuntivo fibroso, com fibras e fibrócitos dispostos paralelamente a sua superfície, que se apresentava integra, indicando que a matriz compatibilizou-se com o leito, servindo como ancoragem aos fibroblastos e, conseqüentemente, com as fibras por eles produzidas.
Em algumas áreas da matriz, exibindo células gigantes multinucleadas, mas sem a presença de linfócitos e / ou plasmócitos, observou-se maior grau de reabsorção (figura 1B).
Período de 30 dias: Na maioria dos casos, os espaços centrais da FBB estavam ocupados por tecido conjuntivo frouxo, enquanto os mais periféricos estavam preenchidos por tecido adiposo característico do tecido subcutâneo da região (figura 2A).
Período de 60 dias: A substituição do tecido conjuntivo frouxo por tecido adiposo também foi observada nos espaços centrais da FBB e algumas áreas da matriz apresentavam sinais de absorção, exibindo em sua superfície tecido conjuntivo circundante com fibrilas colágenas dispersas (figura 2B). Nesse período foi evidente uma redução significante das trabéculas ósseas da matriz implantada.
Análise semiquantitativa
Os resultados semiquantitativos das observações das lâminas estão resumidos na tabela 1 e foram agrupados em função dos períodos experimentais, quanto ao infiltrado inflamatório, presença de vasos sanguíneos e grau de fibrosamento.
O tratamento utilizado não induziu diferença significativa no infiltrado inflamatório em relação ao grupo controle.
Ainda, ao longo do tempo, não foi perceptível diferença significativa com relação a esse parâmetro no grupo controle; porém, para o FBB, o infiltrado inflamatório no período de 10 dias (escore 2) foi significativamente maior que aos 60 dias (escore 0, p < 0,05).
A presença de vasos sanguíneos foi semelhante em ambos os grupos nos respectivos períodos experimentais (p > 0,05). Da mesma forma, não se observou variação significativa para a presença de vasos sanguíneos no grupo controle. No grupo FBB, a redução do escore de 2 para 0 foi significativamente diferente (p < 0,05).
O grau de fibrosamento foi semelhante entre os grupos controle e FBB, mas, para o grupo controle, ao longo dos períodos, aumentou significativamente de 0, aos 10 dias, para 2 aos 30 e 60 dias (p < 0,05). Entretanto, no grupo FBB, a variação de grau 0 de fibrosamento aos 10 dias para grau 1 (20 dias), grau 2 (30 dias) e grau 1 (60 dias) não foi estatisticamente significativa.
DISCUSSÃO
A busca de um biomaterial ideal que possa servir como material carreador de moléculas sinalizadoras e/ou células para a engenharia tecidual vem sendo realizada por muitos pesquisadores. Segundo Jin et al, uma propriedade importante do biomaterial é ter geometria com formato 3D apresentando porosidade e ter tamanho das partículas adequado(17).
Segundo os mesmo autores, a continuidade e interconexão dos poros são de suma importância para a migração celular, invasão capilar e angiogênese. Nesse sentido, salientamos que a matriz aqui testada (FBB) apresenta essas características adequadas, uma vez que as suas porosidades e espaços internos foram rapidamente preenchidos por tecido conjuntivo normal característico da região, demonstrando a biocompatibilidade do material(17).
Uma das desvantagens apontadas por alguns autores(5,18) para a utilização de matriz de osso homóloga e heteróloga como material de enxerto seria o risco de transmissão de doen-(5,18). No entanto, sabe-se que materiais mineralizados ou desmineralizados liofilizados possuem menor risco para a transmissão viral em relação aos frescos congelados, devido à maneira pela qual são processados(19).
Estudos relatam que os materiais ósseos desmineralizados possuem propriedades osteoindutoras(20-23). Essa capacidade de osteoindução origina-se da presença de proteínas morfogenéticas ósseas (bone morphogenetic protein, BMP) na matriz óssea que, quando liberadas, induzem células mesenquimais indiferenciadas a se diferenciarem em condroblastos, estimulam a vascularização do novo tecido e desencadeiam a ossificação endocondral.
Salientamos que, no presente trabalho, em nenhum dos períodos analisados foi notada a ocorrência de ossificação ectópica, como observada para a matriz óssea cortical humana em sítio heterotópico ou matriz óssea cortical bovina em sítio ortotópico de animais de laboratório nos períodos de 12 a 15 dias(22-24).
A ausência de BMPs ou a sua presença em quantidade insuficiente na matriz de osso fetal bovino poderiam explicar a não ocorrência de osteogênese, ou, ainda, as BMPs estarem em estado inativo nessa matriz(25). Outra hipótese para explicar a ausência de formação óssea sugerida por vários pesquisadores em experimentos similares seria a ocorrência de reação imunológica inativando as BMPs porventura existentes e bloqueando a neoformação óssea(26). Killey et al, analisando a resposta celular ao osso bovino misto, isto é, con-tendo tanto a porção mineral como a orgânica, denominado Kiel bone (B. Braun®, Melsungem, Alemanha), implantado na calvária de coelhos, observaram que o aparecimento de células gigantes e a absorção do material estavam associados a uma infiltração linfoplasmocitária, que poderia ter impedido a osteogênese(27).
Contrapondo-se a essa hipótese, salien-te-se que no presente estudo não foram observados linfócitos ou plasmócitos em quantidade que indicasse reação imunológica ao material em nenhum dos períodos analisados. De fato, a matriz de osso fetal bovino (FBB), apesar de ter induzido um infiltrado inflamatório inicial mais intenso, diminuiu significativamente até o período de 60 dias, integrando-se aos tecidos do leito receptor, sendo absorvido lentamente, processo esse mediado, principalmente, por células mononucleares.
CONCLUSÃO
Considerando que o material não induziu destruição tecidual ou recrutamento de células do sistema imunológico, foi parcialmente absorvido e bem tolerado pelo tecido, concluímos que o osso fetal bovino foi biocompatível.
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