Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
1. Pós-graduando do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
2. Aluna de Iniciação Científica do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
3. Técnica do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
4. Professor Associado do Departamento de Biomecânica, Reabilitação e Medicina do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
5. Professor Associado do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Helton L.A. Defino, Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, Av. Bandeirantes, 3.900, 11o and., C. Universitário - 14048- 900 - Ribeirão Preto (SP) - Brasil. E-mail: hladefin@fmrp.usp.br
As lesões traumáticas da medula espinhal desencadeiam reações no tecido, cuja complexidade está diretamente relacionada com o alto grau de diferenciação anatômica e fisiológica do sistema nervoso central(1-2).
O traumatismo da medula espinhal resulta em alterações decorrentes da transferência da energia cinética do trauma para o tecido nervoso, processo comumente denominado de lesão primária. Mecanismos secundários da lesão que abrangem uma seqüência de reações bioquímicas e celulares desencadeadas pelo trauma primário, diretamente dependentes do tempo póslesão (lesão secundária), contribuem também para as conseqüências do traumatismo(2-3).
Além do tecido nervoso, a lesão da medula espinhal atinge os elementos vasculares(4-7). A alteração do fluxo sanguíneo no interior da medula espinhal e a conseqüente redução da perfusão tecidual pós-traumática são um componente importante da lesão medular traumática. A isquemia tecidual pode ser induzida pela lesão direta do leito vascular, pelo espasmo ou pela oclusão dos vasos sanguíneos. A liberação de aminas simpatomiméticas no momento do trauma, a hipotensão póstraumática e a perda da auto-regulação são fatores adicionais que contribuem para a alteração do fluxo sanguíneo intramedular(4-7). A extensão da influência da lesão vascular sobre a patogenia secundária é dependente da ruptura inicial dos vasos sanguíneos, induzindo a proeminente hemorragia intratecidual e a ruptura progressiva da barreira da medula espinhal, que coincide com a infiltração de células inflamatórias.
Esse conjunto de eventos pode influenciar fortemente a lesão da medula espinhal, aguda e cronicamente, definindo em parte a extensão da recuperação funcional. As alterações do fluxo sanguíneo e da perfusão tissular, que produzem dano vascular ao redor do sítio da lesão, ocasionando isquemia regional e lesão neuronal, têm sido estudadas e, no entanto, não foram completamente elucidadas(8-9).
Em contraste com os inúmeros estudos relacionados com os aspectos moleculares, bioquímicos, histológicos ou da microcirculação da medula espinhal relativos às lesões traumáticas, são raras as descrições das alterações macroscópicas do sistema vascular da medula espinhal, tendo sido essa a motivação para a realização do presente estudo. O objetivo do trabalho foi o estudo das alterações vascula-res da medula espinhal induzidas por diferentes traumas mecânicos, considerando-se as alterações imediatas após a lesão e a sua evolução no decorrer do tempo.
MÉTODOS
O estudo foi realizado no Laboratório de Neurofisiologia Molecular da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP. Foram utilizados 72 ratos machos Wistar (250-300g). Os animais foram mantidos em temperatura ambiente constante (23°C), com ciclo de luz claro/escuro de 12 horas (iniciando às 7:00h) e com água e ração ad libitum.
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais de acordo com o procedimento realizado para a produção da lesão da medula espinhal - grupo I: laminectomia; grupo II: contusão da medula espinhal por meio da queda de peso;grupo III: compressão de 35% do canal vertebral; e grupo IV: compressão de 50% do canal vertebral. Cada grupo experimental era formado por 18 animais. Todos os procedimentos foram realizados segundo os critérios estabelecidos pela Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento para experimentos em animais, após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Pre-to-USP.
Os animais foram anestesiados por meio da injeção intraperitoneal de tribromo-etanol (250mg/kg - Aldric Chemical Co., Milwaukee, WI, EUA). A coluna vertebral foi exposta à altura de T10 por meio de incisão posterior e divulsionamento da musculatura paravertebral até a exposição da lâmina de T10. O procedimento cirúrgico foi realizado com o auxílio de microscópio (aumento de 10x).
No grupo I, laminectomia, foram realizadas a remoção bilateral das lâminas vertebrais e a exposição da dura-máter, tendo sido esse grupo utilizado como controle para os demais.
No grupo II, contusão da medula espinhal por meio da que-da de peso (figura 1), a dura-máter foi exposta utilizando-se a técnica descrita para o grupo I. A seguir, a medula espinhal foi lesada por meio do impacto produzido pela queda de um cilindro de 10g de peso sobre sua superfície, a altura de 15cm em relação à medula espinhal exposta. O cilindro utilizado para a produção da lesão deslizava no interior de um tubo posicionado perpendicularmente à superfície da medula espinhal e possuía diâmetro de 3mm na sua extremidade de impacto.
Nos grupos III (35% de compressão do canal vertebral) e IV (50% de compressão do canal vertebral), espaçadores de 0,78mm e 1,11mm (figura 2), de espessura foram posicionados no interior do canal vertebral, abaixo da lâmina de T9, após a exposição da dura-máter, segundo a técnica descrita para o grupo I. O posicionamento dos espaçadores abaixo da lâmina de T9 mimetizou a compressão do canal vertebral. Os espaçadores foram manufaturados a partir de hastes de policarbonato e as suas dimensões foram determinadas (0,78mm de espessura para compressão de 35% e 1,11mm para compressão de 50%) com base em estudos prévios das dimensões do canal vertebral do segmento vertebral T9-T10 de ratos do mesmo sexo e peso(10-11). Observamos no estudo-piloto realizado que a média da altura do canal vertebral ao nível de T9 era de 2,2mm e de 2,24mm ao nível de T10, enquanto a média da largura do canal vertebral era de 3,10mm ao nível de T9 e de 3,15mm ao nível de T10.
Após o procedimento cirúrgico, os músculos, a fáscia paraespinhal e a pele foram suturados utilizando-se fio de náilon 4-0 (Ethicon, São José dos Campos, SP, Brasil). No período pós-operatório os animais foram mantidos em gaiolas (dois ou três em cada) e foram efetuados procedimentos para o esvaziamento da bexiga e prevenção da lesão dos membros paralisados.
O método de avaliação utilizado para o estudo da rede vascular intrínseca da medula espinhal foi a microangiografia, realizada por meio de solução nanquim /gelatina. Para isso, os animais foram anestesiados com dose letal de uretana (1,5g/ kg, Merck) e perfundidos com 0,01M de solução salina-fosfato (pH 7,4), seguido da solução nanquim (25%), gelatina (5%), aplicada na proporção de 1.000ml/kg. Após a perfusão, a medula espinhal do rato foi retirada e fixada em formol (10%) durante cinco dias. O tecido foi desidratado em soluções de concentração crescente de álcool e diafanizado pelo método de Spaltholz(12). A medula espinhal assim tratada tor-na-se semitransparente, o que fornece visão tridimensional dos seus vasos sanguíneos.
A análise quantitativa dos vasos sanguíneos intramedulares foi realizada por meio da medida da intensidade de luz transmitida (intensidade média de cinza, 0-256 nanômetros), utilizando um microscópio invertido acoplado a um computador e sistema de processamento de imagem (Scion Image Processing and Analysis Program). A análise quantitativa foi realizada no local da laminectomia e no sítio da lesão produzida por meio da queda do peso e implantação dos espaçadores.
RESULTADOS
O resultado das alterações vasculares da medula espinhal induzidas pelos diferentes tipos de lesão (queda de peso, compressão de 35 e 50% do canal vertebral), avaliadas nos diferentes períodos após lesão (6, 24, 28, 48h e 7, 35 dias), está ilustrado na figura 3.
A análise quantitativa das alterações vasculares da medula espinhal foi realizada por meio da mensuração da absorbância de luz, em tons de cinza, tendo sido analisados o sítio da lesão, os segmentos rostrais e caudais (tabela 1 e gráfico 1). A análise estatística dos resultados mostrou que a contusão e a compressão de 35 e 50% do canal vertebral induziram alterações da rede vascular medular (MANOVA), efeito do tratamento, F3,52 = 47,13, p < 0,0001. No entanto, não foram observadas modificações no padrão das alterações iniciais da rede vascular medular nos grupos experimentais, ao longo dos diferentes períodos de estudo (MANOVA), efeito do tempo, F4,52 = 1,50, p = 0,20.
O grupo controle, animais que foram submetidos somente à laminectomia, não apresentou variações estatisticamente sigde maior intensidade da rede vascular da medula espinhal ocorreram no grupo em que foi realizada a compressão de 50% do canal vertebral (one-way ANOVA, F3,68 = 47,77, p < 0,001). Os grupos contusão e compressão de 35% apresentaram alterações significativas quando comparados com o grupo controle (laminectomia). No entanto, as alterações observadas nos grupos contusão e compressão de 35% foram semelhantes estatisticamente e menos intensas que aquelas observadas no grupo compressão de 50%.
DISCUSSÃO
As alterações vasculares e a isquemia que ocorrem na medula espinhal após os traumatismos é um dos aspectos mais importantes da lesão secundária(13-14). A alta taxa metabólica dos neurônios faz com que a substância cinzenta seja especialmente sensível à lesão isquêmica(8). O mecanismo exato por meio do qual a lesão por isquemia ocorre não foi ainda completamente esclarecido. A destruição mecânica da microvasculatura causa hemorragia petequial e trombose intravascular que, em combinação com o vasoespasmo dos vasos intactos e o edema no sítio da lesão, podem induzir hipoperfusão local profunda e isquemia(14). Esse é primariamente um fenômeno microvascular e vasos de grosso calibre, como a artéria espinal anterior, são normalmente poupados(9).
Nossos resultados sugerem que a magnitude das lesões vasculares produzidas por estreitamento abrupto do canal vertebral de 35% e por contusão, utilizando um peso de 10g, em queda livre de uma altura de 15cm acima da medula espinhal, são semelhantes. O padrão semelhante de resposta à lesão observado no trauma e no estreitamento do canal vertebral de 35% pode ser devido ao fato de este ter sido realizado de forma abrupta. Por sua vez, as alterações observadas no grupo estreitamento abrupto do canal de 50% foram mais intensas que nos demais grupos. Considerando-se a compressão de 35 e 50% do canal vertebral, a magnitude das alterações vasculares foi coerente com o aumento da compressão do canal vertebral.
Estudos mostram mudanças da evolução clínica dos animais que sofrem lesão traumática da medula espinhal, amplificadas no decorrer do tempo(2-3). Nossa previsão, portanto, seria a observação de alteração no padrão inicial das alterações vasculares. Na análise dos resultados deve-se considerar a possível limitação do método de avaliação utilizado neste estudo.
Existe a possibilidade de que as partículas da solução nanquim/gelatina não atinjam toda a extensão da rede vascular. Na hipótese da ocorrência de alterações vasculares além do nível de retenção das partículas da solução utilizada, estas não poderiam ser detectadas. Essa possibilidade poderia explicar a não observação de mudanças nas alterações vascula-res nos diferentes períodos de observação.
Os estudos no âmbito das alterações da vascularização medular relacionadas ao trauma têm sido direcionados para a microcirculação, utilizando marcadores imunocitoquímicos para células do endotélio vascular como antígeno marcador-1 de célula endotelial e anticorpos contra astróglia(3,14-15).
Esses autores observaram a diminuição da vascularização no período de 48h subseqüente à lesão, seguida de processos de reparo após quatro dias, evidenciado por aumento do número de vasos no centro da lesão. Esses resultados foram interpretados como uma tentativa inicial de reparo da vascularização após a lesão parcial por transecção da medula espinhal de ratos, no sítio da lesão. No entanto, o número de vasos sanguíneos apresentou diminuição uma semana após a lesão; essa reação vascular não foi suficiente para reparar o tecido compacto, não impedindo a formação de cavidade(3,14-15).
Foi observada resposta bifásica dos vasos no sítio da lesão, apresentando na fase inicial uma neovascularização; na segunda fase foi observada redução dos vasos sanguíneos, simultaneamente à remoção dos resíduos celulares e desaparecimento dos macrófagos. O número de vasos sanguíneos diminuía à medida que ocorria o surgimento das cavernas teciduais preenchidas com líquido.
Outros autores utilizaram, semelhante aos nossos estudos, métodos de detecção de vasos desobstruídos que poderiam ser marcados por meio de perfusão aórtica dos animais utilizando resinas. Tator et al(14) e Daneyemez et al(15), utilizando técnica de microangiografia, observaram alterações agudas distintas de alterações tardias do padrão vascular.
No entanto, esses autores, de forma semelhante aos resultados deste estudo, não observaram evidências de oclusão completa dos gran-des vasos intramedulares durante o período de seguimento da lesão. Esses dados reforçariam a hipótese de que as alterações vasculares intramedulares pós-traumáticas ocorreriam na microcirculação. Portanto, essa observação sugere que a manutenção da alteração vascular nos diferentes períodos de seguimento não estaria relacionada às limitações do método de estudo empregado.
CONCLUSÕES
A compressão experimental do canal vertebral de ratos mostrou redução da vascularização da medula espinhal. O padrão da redução da vascularização da medula espinhal permaneceu constante nos diferentes períodos de observação e a redução da vascularização foi proporcional à intensidade da lesão.
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