1. Ortopedista do Serviço de Ortopedia e Traumatologia - Hospital Municipal Miguel Couto - SOT-HMMC - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
2. Médico Residente do Serviço de Ortopedia e Traumatologia - Hospital Municipal Miguel Couto - SOT-HMMC - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
3. Ortopedista e Chefe do Serviço de Ortopedia do Serviço de Ortopedia e Traumatologia - Hospital Municipal Miguel Couto - SOT-HMMC - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
4. Ortopedista do Hospital do Galeão - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
5. Professora do Departamento de Histologia e Embriologia - Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Centro Biomédico, Universidade Estadual do Rio de Janeiro - UERJ - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
6. Mestranda do Departamento de Histologia e Embriologia - Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Centro Biomédico, Universidade Estadual do Rio de Janeiro - UERJ - Rio de Janeiro (RJ), Brasil.
Endereço para correspondência: Vincenzo Giordano, Rua Aristides Espínola, 11/ 301, Leblon - 22440-050 - Rio de Janeiro (RJ), Brasil. Tel.: (21) 2294- 9730; fax: (21) 2274-6830. E-mail: sot.hmmc@terra.com
O osso é o tecido humano mais freqüentemente transplantado(1). Estima-se que nos Estados Unidos da América cerca de 450.000 enxertos ósseos sejam realizados por ano(2). Basicamente, os enxertos ósseos têm sido usados no tratamento de retardes de consolidação e pseudartroses, assim como em inúmeros desafios terapêuticos envolvendo falhas ósseas. Atualmente, o uso do enxerto ósseo autólogo é considerado como procedimento padrão no manejo dessas complicações. Suas propriedades de osteoindução, osteocondução e osteogênese são fundamentais para tal(3-4). No entanto, desvantagens nesse procedimento têm sido repetidamente apontadas (estoque ósseo inadequado, queixas relacionadas ao sítio doa-(5-6)), tornando imperiosa a busca de substitutos que mimetizem as funções principais do enxerto ósseo autólogo. Ao longo dos anos, diversos biomateriais vêm sendo testados com essa finalidade; entretanto, a ausência, principalmente de características osteindutoras, tem frustrado os pesquisadores na maioria dos produtos estudados. A utilização de substitutos ósseos (aloenxerto congelado, matriz óssea desmineralizada, colágeno, hidroxiapatita) e a aplicação de princípios de terapia genética vêm sendo propostas como solução para esse problema(3).
Autores têm demonstrado características osteoindutoras e osteocondutoras capazes de induzir neoformação óssea com o uso desses novos biomateriais(7-8). No entanto, até onde vai nosso conhecimento, nenhum estudo recente foi realizado utilizando aloenxertos frescos. Em teoria, sua capacidade para reparar falhas ósseas e promover estímulo osteogênico parece ter sido relegada a segundo plano pelo risco real de complicações, como infecção e incompatibilidade imunoistoquímica. Para melhor avaliar a capacidade osteogênica dos aloenxertos frescos, foi idealizado estudo experimental em ratos.
Nosso objetivo foi estudar histomorfologicamente o comportamento do aloenxerto fresco e da hidroxiapatita de alta porosidade utilizados para preencher defeito ósseo femoral em ratos.
MÉTODOS
O presente estudo foi realizado no Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital Municipal Miguel Couto, no Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Centro Biomédico, Universidade Estadual do Rio de Janeiro, e no Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Foram utilizados 36 ratos machos da raça Wistar (Rattus norvegicus albinus) com peso médio de 250g no nosso experimento. Os animais foram anestesiados com éter e cloridrato de quetamina (Ketamin®). Foi realizada antibioticoprofilaxia com cefazolina sódica (Kefazol®) intramuscular (50mg/kg) no momento da indução anestésica.
Através de acesso lateral na coxa direita, um segmento ósseo cilíndrico de 5mm de comprimento foi ressecado na diáfise do fêmur direito. Os defeitos ósseos foram estabilizados com um fio de Kirschner de 1,5mm intramedular. Os planos profundos foram fechados em bloco com fio trançado de poliglactina 910, absorvível, 2-0 (Vicryl®) e a pele com monofilamento de náilon preto, não absorvível, 3-0 (Mononylon®), sendo aplicado curativo com gaze e ataduras de crepe. Permi-tiu-se carga total assim que os animais se recuperaram da anestesia. Água fresca e ração-padrão foram oferecidas ad libitum. Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos. O grupo 1 (n = 12) foi utilizado como grupo controle, mantendo-se a falha óssea de 5mm com a fixação intramedular. No grupo 2 (n = 12), dois animais foram sempre operados ao mesmo tempo. O segmento ósseo ressecado de um rato foi utilizado para preenchimento imediato da falha óssea do outro animal (aloenxerto fresco). O grupo 3 (n = 12) recebeu hidroxiapatita de alta porosidade (Pyrost®) em quantidade suficiente para preencher a falha óssea criada. Todas as osteotomias foram estabilizadas com um fio de Kirschner 1,5mm. Seis animais de cada grupo foram sacrificados por secção medular cervical quatro e oito semanas após o procedimento cirúrgico. Esse método é recomendado pela convenção européia para a proteção de animais vertebrados usados em experimentos e outros propósitos científicos(9).
Os animais tiveram seus membros inferiores direitos desarticulados no nível do joelho e quadril. O calo ósseo foi dissecado preservando-se o envelope de partes moles adjacente e o segmento coletado imediatamente fixado em paraformaldeído a 10% por cinco dias.
A análise histológica foi realizada por meio de microscopia de luz (microscópio Nikon®). Após a fixação, o calo foi descalcificado em ácido nítrico a 5% por cinco dias, desidratado em etanol e incluído em parafina. Cortes de 5µm foram obtidos em fatias e corados por hematoxilina e eosina, picrossírius com luz polarizada e alcian blue pH 2,5, segundo metodologia descrita por Bancroft e Cook(10).
Análise histomorfológica foi realizada no final do experimento. As lâminas histológicas, de material colhido em três ratos de cada grupo, foram examinadas por vez sem o conhecimento do tratamento a que os animais foram submetidos. O estágio de consolidação óssea foi determinado pela escala de cinco pontos descrita por Allen et al(11). De acordo com essa escala, o grau 0 indica a formação de pseudartrose; grau 1 representa união cartilaginosa incompleta (presença de elementos fibrosos na ponte de cartilagem); grau 2 representa união cartilaginosa completa (ponte de cartilagem hialina bem formada unindo os fragmentos); grau 3 representa consolidação incompleta (presença de pequena quantidade de cartilagem no calo); e grau 4 representa união óssea completa.
RESULTADOS
Grupo 1: no grupo controle, com quatro semanas os animais não apresentavam aspecto macroscópico de consolidação, existindo discreta mobilidade no local do defeito ósseo após a retirada do fio intramedular. Microscopicamente, o periósteo encontrava-se elevado e fino, com calo periosteal pequeno e misto, predominantemente fibrocartilaginoso. Ha-via grande área fibrosa com vasos, caracterizando retarde de consolidação (figura 1). Após oito semanas, houve persistência da mobilidade no local do defeito ósseo após a retirada do fio de Kirschner. Histologicamente, o aspecto foi de pseudartrose, com enorme quantidade de calo cartilaginoso preenchendo a falha criada experimentalmente (figura 2). Na peri-feria, observou-se periósteo mais espessado, com alguma formação de calo ósseo imaturo. A ponte cartilaginosa foi completa em todos os animais, caracterizando o grau 2 de Allen et (11) (figura 3).
Grupo 2: no grupo do aloenxerto, com quatro semanas, tanto o aspecto macroscópico quanto o microscópico foram bastante semelhantes aos dos animais do grupo 1. Histologicamente, observou-se grande quantidade de calo misto (fibroso, cartilaginoso e ósseo) distribuído ao longo do defeito (figura 4). Apesar da maior exuberância do tecido ósseo nesse grupo com relação ao grupo 1 na mesma fase, o que se notou foi ponte fibrocartilaginosa unindo os fragmentos ósseos e presença de restos de hematoma nesse local. Não foi possível observar qualquer tipo de reação do periósteo. Com oito semanas, macroscopicamente havia franca mobilidade entre os fragmentos ósseos após a remoção do fio de Kirschner. Histologicamente, o aspecto foi igual ao do grupo 1, com ponte completa de cartilagem em todos os animais e aspecto de pseudartrose, denotando grau 2 de Allen et al(11). Diferentemente dos outros grupos experimentais, no grupo do aloenxerto, em maior aumento, foram observadas inúmeras células gigantes multinucleadas (osteoclastos), sugerindo aspecto de reação tipo corpo estranho (figura 5).
Grupo 3: no grupo da hidroxiapatita, após quatro semanas os animais apresentavam discreta mobilidade no local do defeito ósseo quando foi retirado o fio intramedular. Histologicamente, o periósteo estava ligeiramente elevado e espesso, com formação de calo periosteal misto, predominantemente osteocartilaginoso. Havia grande quantidade de tecido ósseo neoformado ao longo de todo o defeito (figura 6A). Em maior aumento, foi possível observar inúmeros osteoblastos de superfície aumentados de tamanho, denotando acentuada atividade secretora (figura 6B). Com oito semanas, macroscópica e microscopicamente, todos os animais tiveram seus defeitos ósseos consolidados. Não havia nenhum movimento no foco. Histologicamente, três animais apresentavam calo imaturo unindo os fragmentos ósseos completamente, caracterizando o grau 4 de Allen et al(11). Os outros três animais apresentavam aspecto de remodelação no local do defeito, com periósteo ainda espessado e diferentes estágios de maturação do calo neoformado. Em geral, a medula óssea ainda não havia sido refeita por completo. Em maior aumento, observaram-se nitidamente os diferentes estágios de remodelação do tecido ósseo neoformado (figura 7).
DISCUSSÃO
Os exatos mecanismos implicados in vivo na gênese do tecido ósseo são controversos, exigindo íntimo equilíbrio entre formação (osteoblastos) e reabsorção (osteoclastos)(3,12). O conceito de neoformação óssea promovida por substâncias osteoindutoras e osteocondutoras não é recente, sendo a diferenciação das células osteoprogenitoras em osteoblastos o evento fundamental para o seu sucesso(13-15). Em termos práticos, o uso de auto-enxerto para o preenchimento de uma falha óssea ou para estimular o reparo de fraturas baseia-se na sua capacidade de regulação dos potenciais autócrino e parácrino dos osteoblastos(3). A atividade biológica ideal do auto-enxer-to, em última análise, é o somatório de suas capacidades osteogênica, osteocondutora e osteoindutora(16). Apesar disso, diversos estudos na literatura vêm apontando problemas relacionados ao uso deste tipo de enxerto ósseo. Goulet et al encontraram 37,9% dos seus 87 pacientes submetidos à retirada de enxerto ósseo da crista ilíaca com dor no sítio doador seis meses após o procedimento. Além disso, quatro pacientes evoluíram com infecção no local doador(6). Younger et al observaram 2,5% de 239 pacientes com dor após seis meses do procedimento de retirada de enxerto do ilíaco. Seis pacientes evoluíram com infecção no sítio doador, três com perda sensitiva nesse local e três com osteomielite(5). Pesquisadores têm investigado o papel dos substitutos ósseos, incluindo os fatores de crescimento e diferenciação do osso e da terapia genética de recombinação, como possíveis alternativas ao uso do auto-enxerto(3,17).
Em nosso estudo, procuramos averiguar o comportamento histomorfológico do aloenxerto fresco e da hidroxiapatita de alta porosidade. Teoricamente, o uso do aloenxerto fresco poderia ser realizado entre familiares, a exemplo do que já foi feito no passado em procedimentos ortopédicos e o é atualmente em transplantes de sangue, rim, fígado e de outros ór-(18-20). Utilizamos três grupos experimentais, criando defeito ósseo diafisário de 5mm no fêmur de ratos. Augat et al demonstraram que a capacidade de regeneração óssea diminui quanto maior a distância entre as extremidades ósseas(21). Esses autores observaram que defeitos de 6mm evoluem clínica e histologicamente para pseudartrose. Em um dos grupos, usado como controle, o defeito ósseo foi criado e não enxertado. No segundo grupo, denominado aloenxerto, o defeito ósseo foi preenchido com osso cortical de outro animal. Para tal, foram operados dois ratos simultaneamente para que os fragmentos ósseos fossem trocados. No terceiro grupo, a falha óssea foi preenchida com hidroxiapatita de alta porosidade. Todos os animais tiveram o fêmur direito fixado com um fio de Kirschner intramedular com o objetivo de reduzir a carga no segmento estudado apenas a movimentos axiais. A utilização desse tipo de fixação é comum a outros estudos experimentais, sendo considerada um excelente modelo dinâmico para avaliação do processo de osteogênese em co-(21-24). A qualidade do tecido neoformado ao longo do defeito ósseo experimentalmente produzido foi analisada histologicamente por microscopia de luz. Tem sido mostrado que a qualidade do tecido neoformado é um indicador fiel da estabilidade mecânica na zona de falha óssea(21).
A utilização de aloenxertos na prática ortopédica apresenta, em teoria, inúmeras vantagens sobre os auto-enxertos(17-18). Os aloenxertos podem fornecer grande capacidade estrutural, ser obtidos em larga quantidade e não incorrem em dor no sítio doador(19). No entanto, seu uso não é isento de riscos, podendo haver intensa reação imunológica contra as células presentes no enxerto(20). Assim, atualmente, os aloenxertos são preparados, limpos e processados para remover todas as células e reduzir a reação imune e o risco de contaminação viral no hospedeiro(18). Devido à perda das células, os aloenxertos não apresentam a propriedade osteogênica presente nos autoenxertos. Os processos envolvidos na incorporação dos aloenxertos são qualitativamente similares aos do auto-enxerto nãovascularizado; no entanto, ocorrem mais lentamente e são acompanhados por quantidade variável de inflamação, em muito atribuída à resposta imunológica do hospedeiro(18-19). Tal fenômeno imunológico se dá pelo fato de esses implantes serem reconhecidos como corpos estranhos(18-20,25). A intensidade da reação é diretamente dependente do tipo de aloenxerto. Diversos autores vêm mostrando ampla evidência de que os aloenxertos frescos induzem a produção de anticorpos específicos. Horowitz e Friedlaender demonstraram ativação de linfócitos T CD4+ e CD8+ com reatividade específica para antígenos classes I e II(26). Esses autores têm sugerido que células presentes na cortical óssea são capazes de ativar os linfócitos T, o que pode explicar, em parte, a associação entre o uso do aloenxerto fresco e a intensa reação imunológica dos hospedeiros vista no presente experimento. Uma vez ativados, tanto os linfócitos T CD4+ quanto os CD8+ secretam citocinas capazes de influenciar muitas outras células do sistema imunológico, como linfócitos B, macrófagos e células gigantes multi-nucleadas(26). Nos animais do grupo 2 (aloenxerto) ocorreram achados curiosos nas duas fases estudadas. Após quatro semanas de experimento, observou-se intensa reação inflamatória na região da falha óssea, caracterizada pela presença de restos de hematoma e grande quantidade de tecido fibroblástico. Após oito semanas do procedimento de enxertia, foram notadas inúmeras células gigantes multinucleadas, tipo osteoclastos em meio de um calo misto. Com relação à propriedade de promover consolidação óssea, os animais desse grupo (assim como os do grupo 1) evoluíram para pseudartrose, com enorme quantidade de calo cartilaginoso preenchendo a falha criada experimentalmente (ponte cartilaginosa completa). Talvez o curto período do estudo (oito semanas) tenha influenciado esse resultado. Sabe-se que a incorporação da maioria dos aloenxertos ocorre através de junção cortical-cortical ou medular-medular(19). Especificamente, na junção cortical há neoformação óssea por ossificação intramembranosa através da reconstituição do periósteo. A exemplo do que ocorre no auto-enxerto cortical não-vascularizado, aloenxertos corticais sofrem processo de revascularização lento devido à sua densidade óssea aumentada(19,27).
Eid et al, em estudo experimental em ratos, demonstraram a presença de propriedades osteoindutoras e de osteocompatibilidade na matriz óssea desmineralizada(28). Em geral, a implantação desse substituto ósseo é seguida por agregação plaquetária, formação de hematoma e migração de leucócitos polimorfonucleares para dentro do implante nas primeiras 18 horas. Por volta do quinto dia, ocorre diferenciação celular com aparecimento de condrócitos. No décimo dia, há invasão vascular acompanhada por osteoblastos. Nesse momento sur-gem células multinucleadas e ocorre apoptose dos condrócitos. O fenômeno da migração de capilares, tecidos perivasculares e células osteoprogenitoras através dos poros existentes no tecido transplantado é crucial para que ocorra neoformação de tecido osteóide. Tem sido demonstrado que o tamanho ideal do poro para que haja crescimento ósseo é de 100 a 500µm(29). Outro fator de fundamental importância é a existência de interconexões trabeculares maiores de que 100µm para que ocorra comunicação intercelular apropriada(30).
Com o tempo, o implante desmineralizado é reabsorvido e substituído pelo osso hospedeiro e há remodelação óssea(16,19,29). Nos-sos resultados demonstraram que a hidroxiapatita de alta porosidade promoveu consolidação entre as extremidades ósseas após oito semanas, apresentando padrão histológico de remodelação em três animais. Tsuang et al estudaram culturas de osteoblastos de ratos com a finalidade de avaliar o comportamento desse grupo celular com a hidroxiapatita de alta poro-sidade(31). Esses autores observaram que ocorre íntima adesão celular aos poros do biomaterial estudado, fornecendo ambiente adequado para que ocorra crescimento dessas células(31). Outros autores têm observado resultados semelhantes após o uso de matriz óssea desmineralizada(32-33).
CONCLUSÕES
1) O uso de hidroxiapatita de alta porosidade é uma boa opção para a cobertura de defeitos ósseos experimentalmente produzidos em animais.
2) O aloenxerto cortical fresco mostrou-se insatisfatório como substituto ósseo pela lentidão na promoção de osteoneogênese e pelas ingerências de ordem imunológica associadas ao seu uso. Outros estudos devem ser realizados com o propósito de comprovar nossas observações.
2. Vaccaro AR. The role of the osteoconductive scaffold in synthetic bone graft. Orthopedics. 2002;25(5 Suppl):s571-8.
3. Giordano V, Giordano M, Knackfuss IG. Fatores de crescimento e diferenciação ósseos. Efeitos sobre o processo de consolidação de fratura: presente e futuro. RBM Rev Bras Med. 2000;57(9):1018-29.
4. Lane JM, Yasko AW, Tomin E, Cole BJ, Waller S, Browne M, et al. Bone marrow recombinant human bone morphogenetic protein-2 in osseous repair. Clin Orthop Relat Res. 1999;(361):216-27.
5. Younger EM, Chapman MW. Morbidity at bone graft donor sites. J Orthop Trauma. 1989;3(3):192-5.
6. Goulet JA, Senunas LE, DeSilva GL, Greenfield ML. Autogenous iliac crest bone graft. Complications and functional assessment. Clin Orthop Relat Res. 1997;(339):76-81.
7. Cook SD, Salkeld SL, Brinker MR, Wolfe MW, Rueger DC. Use of an osteoinductive biomaterial (rhOP-1) in healing large segmental bone defects. J Orthop Trauma. 1998;12(6):407-12.
8. Lohmann CH, Andreacchio D, Koster G, Carnes DL Jr, Cochran DL, Dean DD, et al.Tissue response and osteoinduction of human bone grafts in vivo. Arch Orthop Trauma Surg. 2001;121(10):583-90.
9. Close B, Banister K, Baumans V, Bernoth EM, Bromage N, Bunyan J, et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 1. DGXI of the European Commission. Lab Anim. 1996;30(4):293-316.
10. Bancroft JD, Cook HC. Manual of histological techniques and their diagnostic application. Edinburgh; New York: Churchill Livingstone; 1994.
11. Allen HL, Wase A, Bear WT. Indomethacin and aspirin: effect of nonsteroidal anti-inflammatory agents on the rate of fracture repair in the rat. Acta Orthop Scand. 1980;51(4):595-600.
12. Einhorn TA. The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop Relat Res. 1998;(355 Suppl):S7-21.
13. Simmons DJ. Fracture healing perspectives. Clin Orthop Relat Res. 1985; (200):100-13. Review.
14. Urist MR, DeLange RJ, Finerman GA. Bone cell differentiation and growth factors. Science. 1983;220(4598):680-6.
15. Urist MR, Mikulski A, Lietze A. Solubilized and insolubilized bone morphogenetic protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(4):1828-32. 16. Owen M. Cell population kinetics of an osteogenic tissue. I. J Cell Biol. 1963;19:19-32.
17. Stevenson S. Enhancement of fracture healing with autogenous and allogeneic bone grafts. Clin Orthop Relat Res. 1998;(355 Suppl):S239- 46. Review.
18. Aaron AD, Wiedel JD. Allograft use in orthopedic surgery. Orthopedics. 1994;17(1):41-8. Review.
19. Bauer TW, Muschler GF. Bone graft materials. An overview of the basic science. Clin Orthop Relat Res. 2000;(371):10-27. Review.
20. Langer F, Czitrom A, Pritzker KP, Gross AE. The immunogenicity of fresh and frozen allogeneic bone. J Bone Joint Surg Am. 1975;57(2):216-20.
21. Augat P, Margevicius K, Simon J, Wolf S, Suger G, Claes L. Local tissue properties in bone healing: influence of size and stability of the osteotomy gap. J Orthop Res. 1998;16(4):475-81.
22. Bitar I, Allende BT, Allende BL, Breglia G, Allende C, Gonzales G, et al. Resultados de la incorporación de aloinjerto óseo libre crioconservado no histocompatible vs. aloinjerto óseo fresco libre no histocompatible: cirugía experimental. Rev Asoc Argent Ortop Traumatol. 2000;65(2):122-9.
23. Claes L, Augat P, Suger G, Wilke HJ. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 1997; 15(4):577-84.
24. Vialle E, Vialle LR, Boechat R, Bley JP, Scussiato R, Busato T, et al: Produção de fratura padronizada de fêmur em ratos. Rev Bras Ortop. 2004; 39(6):323-9.
25. Goldberg VM, Stevenson S. Natural history of autografts and allografts. Clin Orthop Relat Res. 1987;(225):7-16.
26. Horowitz MC, Friedlaender GE. Induction of specific T-cell responsiveness to allogeneic bone. J Bone Joint Surg Am. 1991;73(8): 1157-68.
27. Enneking WF, Mindell ER. Observations on massive retrieved human allografts. J Bone Joint Surg Am. 1991;73(8):1123-42.
28. Eid K, Zelicof S, Perona BP, Sledge CB, Glowacki J. Tissue reactions to particles of bone-substitute materials in intraosseous and heterotopic sites in rats: discrimination of osteoinduction, osteocompatibility and inflammation. J Orthop Res. 2001;19(5):962-9.
29. Parikh SN. Bone graft substitutes in modern orthopedics. Orthopedics. 2002;25(11):1301-9; quiz 1310-1.
30. Hulbert SF, Young FA, Mathews RS, Klawitter JJ, Talbert CD, Stelling FH. Potential of ceramic materials as permanently implantable skeletal prostheses. J Biomed Mater Res. 1970;4(3):433-56.
31. Tsuang YH, Lin FH, Sun JS, Hang YS, Liu HC. In vitro cell behavior of osteoblasts on Pyrost bone substitute. Anat Rec. 1997;247(2):164-9.
32. Einhorn TA, Lane JM, Burstein AH, Kopman CR, Vigorita VJ. The healing of segmental bone defects induced by demineralized bone matrix. A radiographic and biomechanical study. J Bone Joint Surg Am. 1984; 66(2):274-9.
33. Mittelmeier H, Mittelmeier W, Gleitz M. [Pyrost, a spongious, mineral bone substitute. Experimental bases and 13-year clinical experience in over 1000 cases]. Orthopade. 1998;27(2):126-35. German.
