1. Mestre em Bases Gerais da Cirurgia pela Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista "Julio Mesquita Filho" - UNESP - Botucatu (SP), Brasil.
2. Responsável pela Disciplina de Cirurgia Plástica da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista "Julio Mesquita Filho" - UNESP - Botucatu (SP), Brasil.
3. Doutoranda em Bases Gerais da Cirurgia pela Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista "Julio Mesquita Filho" - UNESP - Botucatu (SP), Brasil.
4. Doutor em Ciências; Especialista em Neurofisiologia Clínica e Medicina de Reabilitação; Chefe da Seção de Avaliação e Diagnóstico do Instituto Lauro de Souza Lima - Bauru (SP), Brasil.
5. Coordenador do Laboratório de Anatomia da Universidade do Sagrado Coração de Jesus - Bauru (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Rua Ezequiel Ramos, 11-69, Centro - 17013- 210 - Bauru (SP), Brasil. Tels.: (14) 3222-3550, 9701-0851.
E-mail: driromao@ uol.com.br
Lesões de nervos periféricos podem ser incapacitantes, interrompendo abruptamente uma profissão. As lesões mais freqüentes são as provocadas por esmagamento, que, embora parciais, determinam grandes prejuízos funcionais(1-2). Portanto, devido a sua alta incidência, são muito estudadas, inclusive experimentalmente(3-4).
A lesão por esmagamento é uma modalidade útil para o estudo da regeneração dos nervos periféricos(4). Bridge et al(5) estudaram seis técnicas de esmagamento em ratos e concluíram que todos os animais estudados apresentaram axonotmese sem diferenças significativas. Esta técnica foi considerada confiável e reproduzível como modelo de lesão por esmagamento.
A preservação das estruturas de sustentação do nervo periférico e a velocidade da recuperação funcional permitem a utilização deste método para avaliação da recuperação morfológica e funcional do músculo por ele inervado.
A recuperação completa da função motora após lesão de nervo periférico pressupõe a ocorrência de um conjunto de processos morfológicos e fisiológicos que determinam o retorno da atividade elétrica dos axônios sobre os músculos paralisados. Apesar de todo o avanço técnico obtido com a microcirurgia, ainda não se obtém total recuperação motora, por melhor que tenha sido realizada a reparação do nervo lesado(6).
Galvani, segundo Rodrigues-Añez, no final do século XVIII, foi quem primeiro publicou experiências com preparados neuromusculares e eletricidade em animais. Por mais de dois séculos, os biólogos trabalharam com a revelação de que os músculos esqueléticos se contraem ao ser estimulados com eletricidade e que, ao contrair-se por qualquer motivo, geram uma corrente ou tensão perceptível. As descobertas de Galvani marcaram os inícios da neurofisiologia e do estudo da dinâmica da contração muscular(7). Mas foi Duchenne quem, em 1857, em seu livro L'Électrisation Localisée descreveu os movimentos produzidos por músculos estimulados através da pele por correntes elétricas(8). A partir de então, vários autores realizaram estudos tanto experimentais como em seres humanos sobre os efeitos da estimulação elétrica(9-16).
A atrofia muscular resulta de um período de inatividade muscular, ou mesmo quando o músculo é usado apenas em contrações muito fracas. Quando há desnervação muscular, o processo de atrofia começa imediatamente. Um método de prevenção da atrofia muscular é a estimulação elétrica que retardará e, em alguns casos, evitará a atrofia muscular apesar da desnervação(9).
As investigações sobre o uso da eletroestimulação com finalidade regenerativa são extensas. A estimulação elétrica é procedimento controvertido na literatura. Portanto, não há consenso quanto a intensidade, freqüência, duração e métodos de avaliação utilizados. Vários autores referem ser benéfica e sem prejuízos funcionais(10-13), ao contrário de outros, que afirmam ser nociva, provocando contraturas e espasmos(14-16).
O presente estudo pretende elucidar esses aspectos.
MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Nervos Periféricos e Reinervação Urogenital do Departamento de Urologia da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP).
Foram utilizados 100 ratos da raça Wistar, machos, com massa inicial variando de 170 a 253,5g, média de 212,82g (± 27,24), distribuídos aleatoriamente em cinco grupos com 20 animais cada, denominados A, B, C, D e E. Os animais foram identificados na cauda com marcas coloridas. O grupo A foi o de controle de normalidade; o grupo B sofreu lesão no nervo fibular; o grupo C sofreu lesão no nervo fibular e recebeu eletroestimulação diária; o grupo D sofreu lesão no nervo fibular e recebeu eletroestimulação três dias por semana; e o grupo E foi o de controle de desnervação. Os procedimentos de esmagamento do nervo fibular e secção do mesmo foram efetuados sob anestesia de pentobarbital sódico (30mg/kg) injetados intraperitonealmente. O esmagamento foi efetuado com auxílio de um mesmo porta-agulha da marca Edlo®, modelo G4, fechado até o primeiro dente da cremalheira, por 30 segundos sobre o nervo fibular. A estimulação elétrica era realizada, diariamente, durante 60 dias, ao longo de sete minutos, com corrente elétrica aplicada de maneira contínua, na freqüência de 50 hertz, com duração de 0,5ms e intensidade de 3 volts, sobre o músculo tibial cranial direito. Após 60 dias, foi realizado teste neurofisiológico, avaliando-se latência, duração do potencial de ação muscular e amplitude. Foi feita análise morfométrica do músculo tibial cranial e do nervo fibular comum.
Foram avaliados os seguintes atributos: massa inicial e final dos ratos, massa do músculo tibial cranial direito, teste neurofisiológico, contagem de fibras musculares por campo, morfometria do músculo tibial cranial direito e do nervo fibular comum direito.
Na análise estatística os grupos foram comparados pela técnica da análise de variância. Quando essa análise detectou diferenças significativas, foram aplicados os testes de Tukey e Dunnett para as comparações múltiplas entre as médias. As discussões foram realizadas ao nível de 5% de significância(17).
Todos os procedimentos realizados obedeceram aos princípios éticos da experimentação animal, preconizados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), Protocolo no 412, aprovado em reunião da CEEA (Comissão de Ética na Experimentação Animal) da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP).
Com relação ao método do trabalho, o teste neurofisiológico e a análise morfométrica foram realizados por duas pessoas (AMR e ES), ambas sem conhecimento de a qual grupo os animais pertenciam. Somente após o registro dos dados finais das análises foi revelado o grupo a que o animal pertencia.
RESULTADOS
Massa inicial e final dos ratos
A média e o desvio-padrão da massa inicial dos ratos, em gramas, no grupo A, foram de 201,83g (± 13,28); no grupo B, de 223,79g (± 35,01); no grupo C, de 221,83g (± 21,07); no grupo D, de 226,15g (± 21,25); e no grupo E, de 196,87g (± 15,19), não apresentando diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05).
A massa final dos ratos, em gramas, no grupo A foi de 370,72g (± 37,01); no grupo B, de 385,26g (± 33,11); no grupo C, de 423,61g (± 37,74); no grupo D, de 415,29g (± 38,76); e no grupo E, de 482,53g (± 51,12). O resultado da análise de variância, para a massa final dos ratos, foi significativo em nível de 5% de probabilidade (p < 0,05). A diferença ocorreu entre o grupo E e os grupos A, B, C e D. Não houve diferença quando comparados os grupos B, C e D (tabela 1).
Contagem do no de fibras musculares, massa do MTCd e morfometria do MTCd
A análise de variância para a contagem do número de fibras musculares foi significante (p < 0,05). Os testes de Tukey e Dunnett foram aplicados e mostraram diferenças significantes nas comparações entre o grupo E e os demais. Entre os grupos B, C e D, não houve diferença.
O resultado para a massa do MTCd foi significativo (p < 0,05). A diferença foi entre o grupo E e os demais grupos. Quando comparados os grupos B, C e D, a diferença foi entre o grupo C e os demais (p < 0,05).
Com relação à área das fibras musculares o grupo A mostrou diferença entre o grupo E, que teve média inferior à dos demais grupos. Nas comparações entre os grupos B, C e D, a análise mostrou que o grupo D foi superior ao grupo C (p < 0,05). Para o diâmetro mínimo, o resultado indicou diferenças (p < 0,05). O grupo E foi inferior e diferente dos demais. Não houve diferenças entre os grupos A, B, C e D e, para o diâmetro máximo, os testes de Tukey e Dunnett foram aplicados e mostraram diferenças significantes nas comparações entre o grupo E e os demais. Entre os grupos B, C e D, houve diferenças, sendo o grupo D maior que o grupo C (tabela 2).
Teste neurofisiológico
A média e o desvio-padrão da latência, em ms, no grupo A foram de 1,57 (± 0,21); no grupo B, de 1,9 (± 0,34); no grupo C, de 2,03 (± 0,47); no grupo D, de 1,98 (± 0,36); e no grupo E, de 1,82 (± 0,84). A análise de variância indicou diferenças significantes (p < 0,05) entre o grupo A, que foi inferior, e os demais grupos. O grupo E não foi diferente dos grupos B, C e D.
O resultado para a variável duração, em ms, no grupo A foi de 2,43 (± 0,35); no grupo B, de 2,66 (± 0,46); no grupo C, de 2,66 (± 0,38); no grupo D, de 2,48 (± 0,38); e no grupo E, de 2,80 (± 2,60), não apresentando diferenças estatisticamente significativas entre qualquer um dos grupos (p > 0,05).
O teste ANOVA para a amplitude do potencial de ação muscular dos ratos dos grupos em estudo apresentou diferenças entre os grupos A e E, controles de normalidade e desnervação, respectivamente. Entre os grupos B, C e D, não houve diferença (tabela 3).
Morfometria do nervo fibular direito
No grupo A, a média da área das fibras nervosas, em µm2, foi de 27,30 (± 4,00); no grupo B, de 21,05 (± 2,97); no grupo C, de 22,42 (± 4,14); no grupo D, de 18,02 (± 2,88); e no grupo E, de 13,57 (± 2,11).
A média e o respectivo desvio-padrão do diâmetro mínimo das fibras nervosas, em µm, no grupo A foram de 8,84 (± 1,98); no grupo B, de 7,15 (± 1,15); no grupo C, de 7,30 (± 1,54); no grupo D, de 5,59 (± 0,97); e no grupo E, de 4,77 (± 0,83).
O diâmetro máximo das fibras nervosas, em µm, no grupo A foi de 13,06 (± 1,67); no grupo B, de 10,07 (± 1,60); no grupo C, de 10,90 (± 2,19); no grupo D, de 8,88 (± 1,54); e no grupo E, de 6,38 (± 1,00).
O teste de análise de variância foi aplicado e mostrou diferenças nas comparações entre os grupos. O grupo A foi maior que os demais grupos. O grupo E foi menor que os demais grupos. Entre os grupos B, C e D, o grupo D foi menor que os demais. Não houve diferença entre os grupos B e C (tabela 4).
DISCUSSÃO
O rato foi escolhido para este estudo por ser animal resistente, que ocupa pouco espaço, vantagem que se acentua em amostras de número elevado e estudos de longa duração, o que está em concordância com Ellis e McCaffrey(18).
As lesões e a regeneração que ocorrem com o nervo ciático e seus ramos, no rato, são muito semelhantes às do humano. Isso torna este modelo muito utilizado em experimentação sobre regeneração nervosa(3-5).
A técnica de esmagamento de nervo foi escolhida por ser de fácil realização e determinar lesão nervosa do tipo axonotmese. Além disso, não necessita de reparos cirúrgicos, o que evita a introdução de outras variáveis. Isso a torna muito utilizada por diversos autores(3-4).
A massa inicial dos ratos dos cinco grupos estudados não mostrou diferenças estatísticas, comprovando-se, assim, a homogeneidade da amostra. Esse detalhe é muito importante em estudos onde a massa de algum músculo é avaliada, pois a mesma, habitualmente, corresponde à massa do animal(19).
A menor massa do músculo tibial cranial direito do grupo E, desnervado, em relação aos demais grupos era esperada.Entretanto, esperávamos que o grupo A fosse maior que os grupos B, C, e D, que sofreram esmagamento do nervo. Talvez se a eutanásia dos animais fosse em outro intervalo, mais precoce ou tardiamente, essa diferença pudesse ter sido detectada. Outra hipótese é a não efetividade do esmagamento realizado como produtor de lesão nervosa. A análise específica dos três grupos tratados, B, C e D, mostrou que não houve diferença entre os grupos B, não eletroestimulado, e o grupo D, eletroestimulado três vezes por semana. Também houve diferença entre o grupo C em relação ao B e D. Isso leva a pensar que esse esquema de estimulação, diário, pode ter sido prejudicial ao trofismo das fibras nervosas, ao contrário do esquema de estimulação três vezes por semana, que pode ter sido benéfico.
Em relação à área das fibras musculares, o grupo E foi inferior aos demais, o que era esperado. Novamente aqui, como o ocorrido com o peso dos músculos, estranhamos que o grupo A não tenha sido superior aos grupos B, C e D. Talvez o intervalo da eutanásia dos animais não tenha sido adequado para acusar diferenças entre esses grupos ou a lesão nervosa não foi efetiva. Esse atributo permitiu identificar diferenças entre os grupos com estimulação elétrica, sendo D maior do que C, ou seja, novamente aqui parece que a estimulação elétrica três vezes por semana foi mais efetiva que a estimulação diária, ou até que esta foi prejudicial. Entretanto, esse atributo não mostrou diferenças entre os grupos C e D em relação ao grupo B, sem eletroestimulação, levando a pensar que a eletroestimulação não teve qualquer benefício.
O maior diâmetro está diretamente relacionado à área das fibras musculares; portanto, os resultados foram semelhantes aos achados descritos anteriormente para a área.
De acordo com Junqueira e Carneiro(20), o aumento da área e do diâmetro indica o trofismo muscular. Assim, os baixos valores encontrados no grupo E indicam atrofia muscular.
Quanto ao diâmetro mínimo, encontrou-se resultado similar ao da área e diâmetro máximo quando analisados todos os grupos. Entretanto, quando se analisaram especificamente os grupos B, C e D entre si, ao contrário dos atributos citados anteriormente, esses três grupos não mostraram diferenças. O diâmetro mínimo é mais sensível que a área e diâmetro máximo, já que não sofre interferência da inclinação do corte transversal das fibras musculares(19). No presente estudo, esse fato fica bem evidenciado. Assim, a eletroestimulação diária ou três vezes por semana pode não ter tido qualquer efeito sobre a fibra muscular. Por outro lado, o intervalo do sacrifício dos animais pode não ter sido o mais adequado. Talvez se a eutanásia dos animais tivesse sido realizada imediatamente após o final da eletroestimulação, diferenças poderiam ter sido encontradas entre os grupos A, B, C e D.
Na contagem do número de fibras musculares por campo, foi observado o mesmo comportamento encontrado no resultado do diâmetro mínimo, evidenciando a elevada sensibilidade desse atributo, maior do que a massa muscular, área e diâmetro máximo das fibras musculares. Embora pouco utilizada, a contagem das fibras que aparecem por inteiro num determinado campo microscópio ou na tela de um monitor, parâmetro introduzido por Viterbo et al, é método sensível e de rápida execução(21). Ressalva-se aqui, mais uma vez, que talvez o tempo de observação dos animais tenha sido inadequado. Além disso, a intensidade, a freqüência e a duração utilizadas na eletroestimulação podem também não ter sido adequadas.
A área das fibras nervosas, ainda que tenham sido avaliadas na sua porção proximal, apresentou diferenças entre os grupos. O grupo A foi superior aos grupos tratados e o grupo E, ao contrário, foi inferior a esses grupos. Talvez isso seja explicado pela degeneração que ocorre na porção proximal à lesão nervosa(22).
Os resultados do maior e menor diâmetro das fibras nervosas acompanharam a área. Isso indica que o corte foi feito com pouca inclinação, o que demonstra a alta qualidade técnica empregada.
No teste neurofisiológico a amplitude do potencial de ação muscular demonstrou maior sensibilidade às alterações quanto ao esmagamento e à estimulação elétrica. A amplitude do potencial de ação muscular teve comportamento similar ao diâmetro mínimo das fibras musculares, revelando ser método de elevada sensibilidade. A latência e a duração não detectaram alterações nos aspectos avaliados. No resultado referente à latência, o grupo A teve resultado menor que os demais grupos. Esse fato, aliado a não termos encontrado diferenças entre os grupos B, C, D e E, reflete que esse atributo é sensível a qualquer lesão nervosa, esmagamento ou secção. Entretanto, não foi sensível suficiente para detectar alterações entre os grupos que sofreram ou não eletroestimulação e nem mesmo entre o grupo desnervado, grupo E, e os que sofreram esmagamento.
Esses resultados estão de acordo com Stashuk(23), segundo o qual o aumento da latência reflete retarde de condução elétrica. Quanto à duração do potencial de ação motor composto, as diferenças não foram estatisticamente significativas. Qualquer processo patológico que diminua a velocidade de condução de uma porção dos axônios pode causar aumento na duração do PAMC(24). Ao não mostrar diferença nem mesmo entre o controle de normalidade e controle de desnervação, fica evidente que esse atributo não tem especificidade adequada para detectar as alterações estudadas. Portanto, nos grupos que sofreram esmagamento do nervo fibular comum, não houve diferença significativa em relação aos grupos que receberam eletroestimulação e os grupos que não receberam eletroestimulação.
Analisando conjuntamente os atributos referentes às fibras musculares, observa-se que o menor diâmetro e a contagem das fibras, seguidas pela amplitude do potencial de ação muscular, foram os testes mais sensíveis, capazes de detectar diferenças não encontradas na análise da área, maior diâmetro, peso do músculo e pelos demais parâmetros neurofisiológicos realizados.
A ausência de diferença entre os estimulados e não estimulados leva a algumas reflexões. Pode-se pensar na não eficácia da eletroestimulação, contrário à maioria dos autores, que a defendem, mas de acordo com alguns deles, que não acreditam nessa técnica. Pode-se pensar ainda que as características da eletroestimulação, como intensidade, duração, freqüência, ou o tempo de sua realização, tenham sido insuficientes. Talvez o intervalo esperado até fazer-se o teste neurofisiológico e a eutanásia dos animais tenham sido inadequados, tardios ou precoces, para mostrar os efeitos da desnervação e da eletroestimulação.
CONCLUSÃO
O modelo experimental de lesão nervosa por esmagamento, utilizado nesta pesquisa, não foi efetivo para determinar atrofia muscular. A estimulação elétrica, na intensidade e freqüência realizadas, não foi eficiente para alterar o trofismo muscular. O diâmetro mínimo das fibras musculares, a contagem das fibras musculares e a amplitude do potencial de ação muscular foram os atributos mais sensíveis.
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