INTRODUÇÃO
Materiais hemostáticos e/ou antifibrinolíticos participam em geral do processo de formação do coágulo sanguíneo, que consiste na conversão da protrombina, na formação de fibrina e, finalmente, na retração do coágulo.
O sangramento pós-perfusão pode ser devido à deficiente hemostasia mecânica ou aos distúrbios da hemostasia, da coagulação ou da fibrinólise(1-3). Assim, após uma lesão, o organismo depende da coagulação para estancar o sangramento e ajudar na cicatrização. Portanto, para que a coagulação ocorra normalmente, ela depende de proteínas do sangue chamadas fatores de coagulação. Se um desses fatores, como, por exemplo, o fator VIII (hemofilia A) ou o fator IX (hemofilia B), estiver em quantidade insuficiente no plasma sanguíneo, o sangramento pode persistir por tempo maior(4). Também foi observado que pacientes com mecanismo hemostático normal podem apresentar hemorragia pós-cirurgia, decorrente de interferências no equilíbrio do sistema fibrinolítico(5).
Esse sistema desempenha papel fundamental na produção do sangramento pós-perfusão. Na tentativa de inibir a sua ocorrência e a conseqüente tendência à hemorragia, foi preconizada por vários autores(1,6-7) a administração de agentes antifibrinolíticos antes e durante a circulação extracorpórea.
Os selantes hemostáticos locais absorvíveis são substâncias com propriedades hemostáticas que, quando colocadas sobre o local e imobilizadas por suturas ou simples compressão, substituem o coágulo sanguíneo.
O ácido épsilon-aminocapróico (EACA) é um agente farmacológico antifibrinolítico, derivado do aminoácido lisina, obtido por meio de síntese química, indicado na prevenção ou redução do sangramento pós-perfusão.
O mecanismo de ação do EACA mostra que, quando administrado em pacientes, combina-se com o plasminogênio e com a plasmina livre, impedindo desse modo que as enzimas fibrinolíticas se liguem aos resíduos de lisina existente na molécula do fibrinogênio(1). Gordon et al(8) consideraram esse fármaco como um potente agente antifibrinolítico, com capacidade de desviar o equilíbrio coagulação/fibrinólise em favor da hemostasia, pela proteção que oferece aos coágulos contra o processo fibrinolítico fisiológico.
O Gelfoam, esponja à base de gelatina, é insolúvel em água e biologicamente reabsorvível, promove o rompimento de plaquetas e sustenta os fios de fibrina(9). Pode ser usado sozinho ou associado com a trombina, em cirurgias para controlar hemorragias excessivas(10). Diversos estudos têm demonstrado que inicialmente provoca uma reação inflamatória, mas sem efeitos deletérios de longa duração na formação óssea(11-13).
A necessidade de terapia de reposição em pacientes com alterações na coagulação pode ser reduzida por circuncisões ou com o uso de selantes de fibrinas(14). De outra maneira, os benefícios substanciais dos selantes de fibrina, relativamente seguros e de baixo custo, podem ser antecipados em um grupo de pacientes com discrasia sanguínea(15).
Tendo em vista que agentes hemostáticos facilitam a formação do coágulo ou impedem sua destruição, este trabalho teve como objetivo estudar histologicamente os efeitos de selantes hemostáticos em tíbias de ratos no processo de reparo em defeitos ósseos, procurando observar a presença de células inflamatórias, de fagocitose e a deposição de tecido ósseo.
MÉTODOS
Foram utilizados 32 ratos (Rattus norvegicus albinus, Holtzman) provenientes do Biotério Central da UNESP de Araraquara, com peso corporal em torno de 120g, os quais foram alimentados com ração granulada e água ad libitum e mantidos em gaiolas individuais em ambiente climatizado. Para os procedimentos cirúrgicos, todos os animais foram anestesiados com injeção intramuscular de Ketamina® base e Cloridrato de Xilazina a 2%® (Vibac do Brasi) na dosagem de 0,08ml e 0,04ml por 100g de peso corporal, respectivamente.
Após a tricotomia e assepsia da superfície anterior dos membros posteriores e com um bisturi contendo lâmina no 11 esterilizada, foi feita uma incisão em torno de 1cm de extensão para possibilitar o deslocamento do retalho e exposição do osso. Com broca esférica no 1/2 previamente esterilizada e montada em micromotor, foram preparadas cavidades de aproximadamente 1 x 5mm de largura e em profundidade, expondo a medula óssea, de maneira que ambas as tíbias recebessem cavidades.
Na tíbia direita a cavidade foi irrigada com solução a 5% de ácido épsilon-aminocapróico (EACA) durante cinco minutos. Em seguida, os retalhos foram rebatidos e as bordas da ferida suturada com fio de Vicryl® (Poligalactina 910, Johnson & Johnson).
Na tíbia esquerda a cavidade foi preenchida com o Gelfoam® e, após a recolocação do retalho em posição, foi realizada a sutura como no membro direito.
No grupo controle os animais (12) passaram pelos mesmos procedimentos do tratado. As cavidades das tíbias foram irrigadas com soro fisiológico e, em seguida, os retalhos das feridas foram rebatidos e suturados, como os anteriores.
Os animais foram colocados em gaiolas de alumínio isoladas e sua recuperação foi acompanha diariamente. Para evitar qualquer desconforto como dor, foi administrado durante os primeiros dias o analgésico ácido acetilsalicílico, na dosagem de 120-300mg/kg em dose única por via oral, como recomendado pela Canadian Council on Animal Care (CCAC).
Em grupos de cinco, os animais foram sacrificados aos sete, 14, 30 e 45 dias após o ato cirúrgico, segundo o protocolo bioético; as tíbias direita e esquerda foram seccionadas com tesoura de ponta romba. Após a remoção do excesso de tecidos, as peças foram fixadas em formalina a 10% durante 72 horas e na seqüência foram descalcificadas em solução de citrato de sódio e ácido fórmico em partes iguais(13) e processadas para inclusão em parafina. Para o estudo histológico foram realizados cortes semi-seriados com seis micrômetros de espessura e corados pela hematoxilina-eosina. Os cortes obtidos foram analisados e fotografados no fotomicroscópio Jenaval (Zeiss®), pertencente à Disciplina de Histologia e Embriologia da UNESP.
Na análise dos resultados foi observada a presença de exudato, células inflamatórias e clásticas, neoformação de fibras colágenas, além de formação de tecido ósseo nas tíbias.
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, em 17/11/2004.
RESULTADOS
A análise histológica mostra, nos defeitos ósseos das tíbias dos animais controle e tratados com EACA e Gelfoam®, progressiva neoformação óssea no decorrer dos períodos de observação.
Grupo controle (GC)
Aos sete dias, o tecido conjuntivo em formação está bastante celularizado, permeando pequenas e delgadas trabéculas ósseas e raras células inflamatórias (figura 1). Aos 14 dias, o defeito ósseo encontra-se parcialmente preenchido por tecido ósseo imaturo, rodeando amplos espaços medulares (figura 2).
Aos 30 dias, no grupo controle o tecido neoformado com grau de maturação variado preenche o defeito ósseo, mostrando que o processo de regeneração está quase completo (figura 3). Aos 45 dias, o tecido ósseo maturo, com espaços medulares definidos, ocupa o defeito ósseo na sua totalidade e a presença de periósteo mostra a regeneração total (figura 4).
Grupo tratado (GT)
Aos sete dias, o grupo com EACA apresenta o defeito ósseo preenchido parcialmente por delgadas trabéculas ósseas neoformadas, imaturas, entre o tecido conjuntivo frouxo com raras células inflamatórias. Nota-se a presença de algumas gotículas do material (figura 5).
Aos sete dias, no grupo com Gelfoam® observa-se o defeito ósseo preenchido pelo material remanescente e vários macrófagos. Na região mais profunda da cavidade nota-se a formação de trabéculas ósseas delgadas e imaturas (figura 6).
Aos 14 dias, o defeito ósseo no grupo EACA mostra-se parcialmente preenchido por trabéculas ósseas mais espessas em relação ao período anterior. Alguns espaços medulares permanecem amplos, indefinidos, enquanto outros encontram-se menores e definidos (figura 7).
No grupo do Gelfoam, aos 14 dias, nos espécimes que não apresentam material remanescente, ocorreu progressão de neoformação óssea, mostrando trabéculas mais espessas e definidas permeando espaços medulares amplos e indefinidos, preenchendo parcialmente o defeito ósseo (figura 8).
Aos 30 dias, o grupo de EACA apresenta maior formação de tecido ósseo, com grau de maturação mais avançado, quando comparado com os períodos anteriores. Os espaços medulares estão diminutos, definidos, embora alguns ainda estejam amplos (figura 9).
Os espécimes do grupo de Gelfoam®, no mesmo período, apresentam, no tecido ósseo formado, maturação mais intensa quando comparada com a dos períodos anteriores. Os espaços medulares em sua maioria estão pequenos e definidos, caracterizando tecido ósseo maduro (figura 10).
Aos 45 dias, os grupos de EACA e Gelfoam® mostram a loja cirúrgica remodelada por tecido ósseo compacto, circundando espaços medulares preenchidos por tecido conjuntivo frouxo. O processo de reparação tecidual foi semelhante para os grupos controle e tratado com EACA e Gelfoam® (figuras 4, 11, 12), mas a análise histológica comparativa mostra que o grupo Gelfoam® apresenta osteogênese mais intensa após a reabsorção do material remanescente verificado aos 14 dias.
Como o objetivo deste trabalho foi verificar se os materiais utilizados - selantes hemostáticos - proporcionam ou não a neoformação óssea, julgamos dispensável a análise morfométrica dos tecidos neoformados.
DISCUSSÃO
Nos procedimentos cirúrgicos em geral, a rápida hemostasia colabora com tempo operatório menor, facilita a visibilidade do campo cirúrgico e a organização do coágulo sanguíneo, o que favorece a reposição tecidual.
Pacientes com mecanismo hemostático normal podem apresentar hemorragia pós-cirurgia decorrente de interferências no equilíbrio do sistema fibrinolítico(5).
O mecanismo de ação do épsilon-ácido aminocapróico (EACA) mostrou que, quando administrado em pacientes, combina-se com o plasminogênio e com a plasmina livre, impedindo desse modo que as enzimas fibrinolíticas se liguem aos resíduos de lisina existentes na molécula de fibrinogênio(1). Portanto, sendo um potente agente antifibrinolítico, tem a capacidade de desviar o equilíbrio coagulação/fibrinólise em favor da hemostasia, pela proteção que oferece aos coágulos contra o processo fibrinolítico fisiológico(8).
A esponja de gelatina absorvível Gelfoam® tem por função coibir as hemorragias dos capilares, das vênulas e das arteríolas, cuja hemostasia não foi obtida por ligaduras e nem por suturas. Ela pode ser usada sozinha ou associada com a trombina, para controlar hemorragias excessivas(10).
A reparação óssea em tíbias de rato do grupo controle mostrou a evolução do reparo do 7o ao 45o dias após o defeito ósseo, iniciando com áreas de neoformação e culminando com o preenchimento total da loja cirúrgica com tecido ósseo maturo. Esses padrões de normalidade relativos à neoformação óssea são similares aos descritos por outros pesquisadores(16-17).
O projeto experimental utilizado em tíbias esquerdas (Gelfoam®), nas quais o agente hemostático foi deixado no local, serviu para criar uma situação na qual alguns efeitos deletédeletérios de materiais implantados seriam maximizados. Tal condição não é freqüentemente esperada para ocorrer clinicamente, mas os resultados possibilitaram esclarecer algumas das complicações cirúrgicas que acontecem quando esses materiais permanecem no local.
Okamoto et al(18) mostraram que o uso do EACA e do implante de adesivo fibrínico (Tissucol®) no processo de reparo alveolar em ratos submetidos à desidratação crônica pela privação de ingestão de líquidos durante nove dias melhorou o quadro fibrinolítico provocado pela desidratação. Assim, os resultados obtidos em nosso trabalho mostraram que a irrigação das lojas cirúrgicas com solução a 5% de épsilon-ácido aminocapróico e a colocação de fragmentos da esponja absorvível de Gelfoam® provocaram reações teciduais qualitativamente similares às do grupo controle. No entanto, a intensidade das reações teciduais no grupo Gelfoam® foi progressivamente maior após a reabsorção do material aos 14 dias.
Os agentes hemostáticos avaliados foram efetivos no controle hemorrágico e favoreceram a organização do coágulo sanguíneo e o reparo ósseo. Todavia, os resultados indicaram que no período inicial de sete dias, nos espécimes que apresentaram resíduos de materiais, a osteogênese foi menos intensa. Porém, no período de 14 dias, em que o Gelfoam foi completamente reabsorvido, houve aceleração de neoformação óssea, tornando-se similar ao EACA e ao controle. Assim, observou-se que esses agentes hemostáticos são compatíveis com as respostas teciduais, pois não induziram reações inflamatórias e proporcionaram a formação de tecido conjuntivo e ósseo, como foi demonstrado por outros pesquisadores(11,16-18).
Nossos resultados foram interpretados como indicando que a permanência de material remanescente em lojas cirúrgicas, em especial no osso, prejudica a osteogênese e pode provocar reação de corpo estranho. Assim, quando do uso de agentes hemostáticos, é necessário todo cuidado para removê-los completamente da ferida cirúrgica.
CONCLUSÃO
Em todos os grupos experimentais, a seqüência de fenômenos biológicos que compõem a reparação óssea esteve presente, havendo apenas diferença na cronologia. As reações apresentadas no reparo ósseo confirmaram a biocompatibilidade dos materiais. O grupo tratado com Gelfoam apresentou discreta aceleração no processo de reparação tecidual em relação aos grupos controle e ao EACA, principalmente no período de 14 dias, quando foi totalmente reabsorvido. Portanto, a remoção total dos agentes hemostáticos nas lojas cirúrgicas acelera o processo de reparação tecidual.
AGRADECIMENTOS
Aos técnicos do Departamento de Morfologia Pedro Sérgio Simões e Luis Antônio Potenza, pelo auxílio nas fases laboratoriais de nossa pesquisa.
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