Como a prevenção da formação de trombos nas anastomoses vasculares é desejável, durante o ato cirúrgico a heparina tem sido um agente anticoagulante muito utilizado na prática clínica, exercendo papel fundamental na prevenção da formação de coágulos, além de possuir, como antídoto, o cloridrato de protamina. O cloridrato de lidocaína é um anestésico local e, dentre os efeitos colaterais, causa vasodilatação quando aplicado diretamente na luz das pequenas artérias e veias.
Komatsu e Tamai(1), em 1968, realizaram com sucesso reimplante de um polegar e utilizaram técnicas de microcirurgia. Ferreira et al(2), em 1974, utilizaram técnicas microcirúrgicas nos reimplantes e apresentaram técnicas de microanastomoses em vasos sanguíneos menores de 2mm. Sincler(3), em 1980, em estudos realizados em modelo experimental em ratos, demonstrou a importância do uso da heparina sódica não-fracionada tópica nas microanastomoses vasculares. Zumiotti et al(4), em 1984, apresentaram os resultados de 86 reimplantes com os melhores resultados nos casos de amputação por ferimentos cortantes com período de isquemia menor que 12 horas. Ferreira e Zumiot-(5), em 1985, discutiram as principais indicações de reimplantes e técnicas empregadas nos membros superiores e salientaram a importância de realizar osteossíntese adequada e reparação primária de nervos e tendões.
Mazzer et al(6), em 1986, estudaram as diferentes soluções medicamentosas utilizadas em microcirurgia para irrigação das suturas vasculares e seus efeitos no endotélio das pequenas artérias em ratos. Cooley e Gould(7), em 1987, estudaram a prevenção de oclusão de artérias e veias por fenômenos tromboembolíticos em reimplantes microcirúrgicos, utilizando terapia com aspirina e heparina sódica não-fracionada em modelos experimentais com ratos. Greenberg et al(8), em 1988, estudaram em 30 coelhos a importância da heparina intravascular em microcirurgia na prevenção de trombose e concluíram que há decréscimo de 10 a 15% de trombose com uso de heparina intravascular. Zumiotti(9), em 1990, defendeu tese de doutorado versando sobre 60 reimplantes de dedos em 31 pacientes. Apresentou histórico da microcirurgia, a revisão ampla dos novos conceitos de indicações para reimplante de dedos e analisou os principais fatores que poderiam influenciar nos resultados funcionais.
Cooley e Gould(10), em 1991, descreveram o mecanismo de formação de coágulo e duas formas de ativação do plasminogênio - tipo uroquinase e tissular - ambos sintetizados pelas células endoteliais, dos quais o tipo tissular é o mais importante. Os autores concluíram que a aplicação tópica desses agentes leva a risco de formação de trombos microvasculares, pois age prontamente na luz do vaso, não causa lesão do endotélio e inibe efetivamente a formação de trombos. Lan et al(11), em 1992, estudaram, em modelo experimental com ratos, o uso sistêmico adjuvante de iloprost e heparina, em três grupos de animais, em diferentes situações, nas quais observaram melhores índices de recanalização das suturas microvasculares. Zumiotti et al(12), em 1993, estudaram o índice de sobrevida dos reimplantes e avaliaram os resultados funcionais em reimplantes por eles realizados. Chen et al(13), em 1995, reforçaram a idéia de que o principal elemento de prevenção da trombose é a perfeita sutura vascular. Essas importantes pesquisas motivaram-nos a realizar este estudo comparativo, que tem por objetivo avaliar a diferença entre o uso isolado da heparina sódica não-fracionada e da heparina sódica não-fracionada associada ao cloridrato de lidocaína nos reimplantes em ratos.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido no Pavilhão "Fernandinho Simonsen" do Departamento de Ortopedia e Traumatologia e na Unidade de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental "Prof. Dr. Álvaro Dino de Almeida" (UTECE) do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. A pesquisa foi realizada com 30 ratos, adultos, machos, albinos, da raça Wistar, com peso entre 360 e 420 gramas, divididos em dois grupos. Quatorze ratos fizeram parte do grupo A, no qual se utilizou, para irrigar as microanastomoses vasculares, a heparina sódica não-fracionada na concentração de 5.000U/ml; 16 ratos que fizeram parte do grupo B, no qual se utilizou heparina sódica não-fracionada na mesma concentração de 5.000U/ml associada ao cloridrato de lidocaína a 2%, sem vasoconstritor.
O microscópio utilizado foi binocular, fixo na mesa cirúrgica da UTECE, controle de foco manual e aumento de 10 a 16 vezes. As pinças foram microvasculares sem dente nas anastomoses vasculares e pinças hemostáticas microvasculares 2A, para fixação dos vasos sanguíneos.
Método cirúrgico
Anestesia - Os animais foram preparados pela UTECE e a anestesia realizada de acordo com a orientação, acompanhamento e supervisão da médica veterinária, na diluição de 0,6ml de cloridrato de ketamina e 0,3ml de cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-diidro-4h-1,3-tiazina, com dose inicial indutora de 0,8ml, aplicada no abdome, intraperitoneal e doses de 0,2ml desta diluição para manutenção da anestesia, conforme necessidade até o término da cirurgia.
Amputação - Após tricotomia de todo o membro posterior direito (pata posterior), realizou-se anti-sepsia da região com polivinilpirrolidona-iodo (10% de iodo ativo) e, com técnica asséptica, realizou-se amputação (fig. 1) no terço médio da coxa direita, incisão circular da pele, dissecção da artéria epigástrica inferior até a gordura cutânea e secção desta, miotomia de todos os grupos musculares, osteotomia do terço médio do fêmur e, finalmente, secção da artéria e veia femoral. Os nervos ciático e femoral fo-ram preservados.
Reimplante - O reimplante começou com encurtamento do fêmur e osteossíntese intramedular com 2,0cm de um fio de Kirschner 1,0mm (fig. 2). Foram realizadas as suturas dos grupos musculares, com cerca de seis pontos em "X", utilizando fio monofilamentar de náilon 3-0, com agulha traumática de 1,5cm.
Com solução com 1,0ml de heparina sódica não-fracionada (5.000U/ml), realizou-se irrigação intraluminal intermitente em cada um dos 14 ratos do grupo A. Com a solução com 1,0ml de heparina sódica não-fracionada (5.000U/ ml) associada a 2,0ml de cloridrato de lidocaína a 2%, rea-lizou-se a irrigação intraluminal em cada um dos 16 ratos do grupo B. A artéria e a veia femoral foram suturadas com técnicas microcirúrgicas (fig. 3), utilizando microscópio com aumento de 10 a 16 vezes. A artéria suturada recebeu de seis a sete pontos simples e a veia, de oito a 10 pontos simples com fio monofilamentar de náilon 10-0, com agulha microcirúrgica.
As suturas foram irrigadas e limpas durante as anastomoses microvasculares, ao acaso. As soluções utilizadas foram a heparina sódica não-fracionada isolada (grupo A) e a heparina sódica não-fracionada associada ao cloridrato de lidocaína a 2%, sem vasoconstritor (grupo B). Ao final, os vasos de cada grupo foram lavados com o restante das soluções preparadas. A compressa de gaze embebida de sangue foi removida após a interrupção do sangramento, e verificada a presença de fluxo sanguíneo com batimentos arteriais satisfatórios a jusante.
A pele foi suturada aplicando-se pontos tipo "Donatti", utilizando fio monofilamentar de náilon 3-0, com agulha traumática de 1,5cm. Os pontos foram aplicados até total fechamento da pele e o curativo feito com polivinilpirrolidona-iodo (10% de iodo ativo).
Os animais permaneceram em observação até completar a recuperação pós-anestésica. Logo a seguir, iniciou-se a administração de cloridrato de tramadol por via oral. Os ratos receberam o cloridrato de tramadol por três dias consecutivos e foram mantidos vivos em gaiolas individuais, sob cuidados diários, com água fresca, ração à vontade, em ambiente apropriado até o 21o dia.
Os animais foram analisados diariamente quanto a aspectos clínicos como: sangramento, perfusão do membro submetido ao reimplante, movimentação ativa e crescimento de pêlos (fig. 4).
Com 21 dias cada rato foi novamente anestesiado, as microanastomoses vasculares foram analisadas quanto ao batimento arterial, formação de coágulo ao redor das suturas e permeabilidade dos vasos. A seguir, foram sacrificados com dose letal de anestésico.
Para a análise estatística calcularam-se para o tempo de cirurgia a média e o desvio padrão e foi aplicado o teste t de Student para amostras independentes, tendo-se fixado 0,01 ou 1,00% como nível de rejeição da hipótese de nulidade.
RESULTADOS
Quarenta ratos foram necessários e restaram 30 que fo-ram utilizados como material deste estudo. Seis animais morreram, quatro durante a indução anestésica e dois durante a cirurgia; dois ratos submetidos ao reimplante apresentaram necrose do membro e falha do reimplante; dois ratos praticaram autofagia na pata operada e, portanto, não foram utilizados nesta pesquisa (tabela 1).
No grupo A, 14 ratos foram operados e durante as microanastomoses vasculares foi utilizada heparina não-fracionada isolada para irrigar o local da anastomose (tabela 2). Com relação ao tempo de cirurgia nesse grupo, a mais rápida ocorreu em 90 minutos e a mais lenta em 99 minutos. O teste t de Student foi aplicado para amostras independentes e a média foi de 94,6 ± 2,5.
No grupo B, 16 animais foram operados e durante as microanastomoses vasculares utilizou-se heparina sódica não-fracionada associada ao cloridrato de lidocaína (tabela 2). Nesse mesmo grupo, a cirurgia mais rápida ocorreu em 78 minutos e a mais lenta, em 88 minutos (tabela 3). O teste t de Student também foi aplicado para amostras independentes, que resultou em 82,7 ± 2,9. Resultando em teste t: p < 0,01 (altamente significante).
Nos casos analisados observou-se a integração dos reimplantes, do ponto de vista macroscópico e funcional. As extremidades apresentavam boa perfusão e durante a locomoção o animal utilizava a pata operada, ainda que claudicasse. O crescimento de pêlos foi normal e a marcha dos animais operados não foi objeto de estudo desta pesquisa.
Houve boa cicatrização dos músculos e do osso compatível com 21 dias de cicatrização. Nenhum animal apresentou complicação, como hemorragia, que necessitasse de antídoto para controle do sangramento, revisão das suturas realizadas e morte por choque hemorrágico. Ocorreu, em dois casos, sangramento pouco maior que o habitual, um no grupo A e um no grupo B, o qual não necessitou de qualquer procedimento especial; no entanto, formou-se um hematoma no local.
O aspecto microscópico do segmento suturado mostrou batimento arterial com permeabilidade vascular arterial e venosa, na análise feita com 21 dias.
Falhas do reimplante ocorreram nos dois grupos, sendo um de cada grupo, ambos com isquemia grave e, conseqüentemente, necrose.
DISCUSSÃO
A necessidade cada vez maior de reimplantes, o sucesso quanto à integração e retorno às funções do segmento submetido ao reimplante têm motivado muitos a pesquisar o assunto. Apesar da melhoria dos recursos tecnológicos, instrumentais microcirúrgicos, treinamentos dos cirurgiões, sugeridos por Acland(14) e Goossens et al(15), deparamos, ainda, com os insucessos, sendo o fenômeno tromboembolítico um dos principais fatores, estando freqüentemente relacionado à lesão vascular no momento do trauma. A coagulação em condições fisiológicas envolve componente vascular, plaquetário e plasmático. Quando um vaso sanguíneo é lesado, ocorre contração dos segmentos lesados, devido às fibras musculares, e há a formação de fibrina com agregação plaquetária. Segundo Cooney et al(16), os pequenos vasos secundários ao trauma estimulam os três fatores conhecidos como tríade de Virchow: lesão da camada íntima do vaso, diminuição do fluxo sanguíneo e aumento da adesividade plaquetária. Assim, os elementos de coagulação são ativados e há a formação do trombo. O mecanismo ocorre através de duas vias: intrínseca e extrínseca. Cooley e Gould(10) dizem que a formação de fibrina começa a ocorrer quando é completada a ativação do fator X, que na presença de cálcio, fator V e fosfolipídeos das plaquetas, promove a transformação da protrombina (fator II) em trombina. A trombina de função enzimática transforma o fibrinogênio (fator I) em fibrina, a qual é solúvel. Posteriormente, através da ação do fator estabilizador de fibrina, o fator XIII, esta se transforma em fibrina estável e insolúvel, promovendo a interrupção da hemorragia, "cascata de coagulação".
A heparina sódica não-fracionada é um mucopolissacarídeo, a qual era originariamente extraída do fígado; hoje, a heparina comercial é obtida de pulmões e intestinos de animais. Nessa forma, é muito heterogênea, com peso molecular variando de 2.000 até 40.000 dáltons, conforme Salzman(17). Um dos principais papéis da heparina é interagir com a antitrombina III e apresenta grande efeito na agregação plaquetária induzida por colágeno. Assim, tem sido um agente antitrombótico utilizado na prática clínica, como referem Engrav et al(18), Cooley e Gould(7), Greenberg et (8), Zinberg et al(19), Braam et al(20), mas não há convicção plena da importância da heparina sódica não-fracionada nas microanastomoses vasculares, isolada e associada ao cloridrato de lidocaína, porque fragmentos de heparina e outros antitrombóticos diretamente na luz dos vasos sanguíneos têm causado lesões da camada íntima. Importantes estudos experimentais realizados por Cooley e Han-(21) e por Glover et al(22), ambos em 1985, causando lesões graves em ratos, contribuíram para essa convicção.
A coagulação é um fenômeno biológico de formação de trombos, que permite o estancamento de hemorragias e impede o extravasamento do sangue quando ocorre uma lesão vascular. Esse complexo fenômeno é conhecido como hemostasia. O componente vascular contribui através da contração das camadas musculares existentes, principal-mente das artérias; esse fenômeno diminui a luz do vaso, permite a formação de fibrina e agregação plaquetária. As veias também dependem da contração vascular, mas, quando o calibre do vaso começa a aumentar, este mecanismo torna-se insuficiente e a participação dos fatores plasmáticos ligados à coagulação tornam-se cada vez mais importantes. Segundo Barreto(23), as plaquetas são partículas de forma esférica, oval ou baciliforme, não nucleadas, que apresentam no seu interior vacúolos e grânulos que, por vezes, se aglomeram, simulando um núcleo. A porção granular denomina-se granulômero e a não-granular, hialômero. O diâmetro da plaqueta é de dois a quatro micrômetros e se origina dos megacariócitos da medula óssea. A produção de plaquetas é regulada por um fator humoral, a trombopoetina. Esta substância é uma alfa-2-globulina, termoestável e não dialisável. Assemelha-se à eritropoetina, a qual estimula os eritrócitos. As plaquetas contêm várias proteínas, tais como o fibrinogênio, outros fatores de coagulação, albumina e enzimas. Contêm, ainda, substâncias como a serotonina, histamina, adrenalina, noradrenalina e importantes minerais. Elas desempenham um importante papel na primeira fase da hemostasia, pois são os primeiros elementos a chegar ao local da lesão vascular a fim de tamponar o endotélio vascular.
O cloridrato de lidocaína é um anestésico local que tem importante efeito vasodilatador. A irrigação dos vasos sanguíneos com lidocaína, durante as anastomoses microvasculares, é realizada por muitos cirurgiões e facilita a execução das suturas devido ao aumento do diâmetro da luz do vaso sanguíneo.
A escolha da utilização de ratos machos, adultos, da raça Wistar deveu-se ao fato de apresentarem baixo custo, se-rem dóceis, haver facilidade para aquisição e serem de fácil manuseio. As dimensões dos vasos operados permitem a aplicação de técnicas microcirúrgicas. Não houve necessidade do uso de antibiótico no pós-operatório devido ao baixo índice de infecção que os ratos apresentam e a técnica cirúrgica ser asséptica. O tempo de coagulação do rato não interferiu nos resultados e foi compensado pelo efeito anticoagulante da heparina sódica não-fracionada.
Para que as amputações fossem semelhantes e não interferissem nos resultados, as secções dos tecidos foram padronizadas. Em estudos realizados, Mattar Júnior et al(24, 25,26) chamaram atenção para o fato de que o sucesso do reimplante dos membros superiores ou inferiores depende, entre outros fatores, do tipo e da extensão das lesões vasculares, nervos e tecido músculo-esquelético.
A osteossíntese com fio de Kirschner, intramedular no fêmur, conferiu estabilidade que permitiu início de formação de calo ósseo exuberante e de boa qualidade. Não foi possível o seguimento do calo ósseo até ao final da consolidação, porque os animais foram sacrificados na terceira semana, portanto, antes da consolidação, e não era este o nosso objetivo. Não foi objeto de estudo desta pesquisa determinar os níveis de atividade de protrombina e tempo de protrombina ativada pelo uso de heparina sódica nãofracionada local.
Como a melhora da técnica cirúrgica ocorreu durante a pesquisa, para que não houvesse interferência deste fator nas operações, elas foram realizadas de modo intercalado e os ratos escolhidos ao acaso, nos dois grupos. Não foi objeto desta pesquisa a análise histológica dos tecidos. Hupkens e Cooley(27), em 1996, compararam a eficiência do anticoagulante heparina com inibidores de agregação plaquetária, ácido acetilsalicílico associado ao dipiridamol na prevenção de trombose em anastomoses microvasculares de artérias e veias femorais de ratos. Concluíram que a heparina é mais eficaz que a associação de ácido acetilsalicílico com dipiridamol. Schumacher et al(28) e Chen et al(13) propuseram estudos com outros agentes antitrombóticos, como a aspirina e a estreptoquinase.
O nervo ciático e o femoral não foram seccionados nas cirurgias para manter a sensibilidade e atividade motora do membro. A conservação dos nervos foi para não prejudicar o resultado da avaliação motora, visto que a recuperação nervosa se faz lentamente, cerca de um milímetro ao dia. O sangramento que ocorreu após a soltura das pinças vasculares representa alterações hemodinâmicas e metabólicas importantes no rato, mas nenhum animal morreu em conseqüência do procedimento cirúrgico.
O objetivo desta pesquisa realizada com todo o esforço ratos foi adquirir conhecimentos obtidos de maneira experimental, visando futura aplicação na microcirurgia e os reimplantes no ser humano. Muitas dúvidas ainda perdu-ram sobre este fascinante tema ligado aos reimplantes.
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