A lesão medular traumática (LMT) é uma das mais devastadoras entre as lesões que podem afetar o ser humano. Seu registro remonta à própria história da medicina.
Este projeto persegue quatro objetivos bem definidos:
1) Instalação de um sistema de estudo de lesões medulares em animais de pequeno porte, com o estabelecimento de um modelo da fase aguda do trauma medular. Isso será conseguido com a montagem e o funcionamento adequado de um aparelho para produzir impacto na medula exposta cirurgicamente, sem seccioná-la.
2) Em segundo lugar, vem a padronização do dano medular. Impactos de altura e velocidade estabelecidos previamente deverão produzir volumes constantes de área medular lesada. Cada parâmetro experimentado deverá ser reprodutível, sempre com resultados idênticos.
3) O terceiro objetivo é instalar um laboratório de estudos de lesões medulares, com reprodução e produção original de pesquisas que possam despertar, no nosso meio, o interesse de jovens pesquisadores. Funcionará dentro de um hospital universitário, fornecendo a estudantes e médicos residentes elementos de iniciação à pesquisa científica nessa área, que inexiste atualmente. Mais do que descobertas eventuais, que até poderão acontecer, esse é um dos principais objetivos que nos movem.
4) Finalmente, uma vez aprovado o modelo, o laboratório tentará participar de estudos multicêntricos. Cerca de 40 aparelhos iguais a esse foram destinados a universidades que trabalham sob coordenação única. Esse aparelho foi especial-mente produzido para nós e é o primeiro enviado à América Latina, estando também disponível atualmente no Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
À medida que nossos testes forem homologados, o laboratório estará apto a completar ou participar de experiências simultâneas.
Este estudo consiste da avaliação histológica da lesão medular, analisando a progressão das alterações secundárias ao trauma por um período de 48 horas.
MATERIAL E MÉTODOS
A lesão medular é feita através de um aparelho denominado Impactor, que consiste de um aparato para posicionamento do rato e para lesão medular, conectado a uma placa de computador, no qual um programa específico analisa diversas variáveis (velocidade e intensidade da lesão, deslocamento da coluna vertebral), a fim de obter uma lesão padronizada.
Os experimentos deverão ser realizados preferencialmente em ratos do tipo Long-Evan, obtidos de uma única fonte, com 77 ± 2 dias, e com pesos de 240 ± 40g (fêmeas) e 360 ± 40g (machos). São mantidos em jejum a partir da noite que ante-cede a cirurgia. Para climatização, os animais devem ser obtidos uma semana antes do experimento e deve-se ter certeza de que não tenham doenças. Se houver necessidade de manter mais de um animal após a cirurgia, deve-se procurar conservar companheiros de gaiola e familiares juntos, pelo risco de luta entre ratos estranhos.
Para a realização da lesão medular é feita anestesia intraperitoneal com pentobarbital (35-55mg/kg para fêmeas e 55-75mg/kg para machos). Recomenda-se que seja administrada a dose mínima e, se não houver anestesia após cinco minutos, deve-se complementá-la. Essa dose deve anestesiar o animal por duas horas. Não se aconselha administração de doses extras. Caso a anestesia se torne excessivamente superficial durante o procedimento, pode-se complementar a dose e contar a partir desse momento o período de uma hora que precede a lesão medular.
Deve-se cateterizar a veia jugular externa com cateteres de silicone, que precisam ser armazenados em solução de álcool a 75% para assegurar esterilidade. Devem ser lavados com solução salina estéril e instalados na veia jugular externa direita (lateral à jugular interna, menor).
A artéria caudal do rato deve ser canulada para monitorização de pressão sanguínea e gasometria. Um cateter de polietileno com 5cm de comprimento deve ser esticado manual-mente para criar uma ponta de menor diâmetro, o que facilita a inserção na artéria. O cateter deve ser conectado a uma seringa de 1ml com um conector de três vias, sendo a 3ª via usada para o transdutor de pressão.
Em seguida, expõe-se a medula espinhal a fim de realizar a lesão experimental. Incisa-se a pele na linha média dorsal, expondo a coluna vertebral entre T8-12. Os músculos que se inserem ao nível de T10-11 devem ser dissecados, usando coagulação bipolar para estancar sangramentos, se necessário. Os processos dorsais de T9-10 são removidos com microssaca-bocados, sem lesar T8 ou a medula espinhal. A abertura deve acomodar a "cabeça" do Impactor com um espaço lateral superior a 2cm.
A lesão medular será feita através do Impactor. Entre as lesões, a ponta do Impactor deve ficar imersa em solução salina isotônica e, logo antes de realizar a lesão, ser limpa com álcool a 95%.
O rato é posicionado sobre uma esponja no aparelho, com clampeamento dos processos dorsais de T8 e T11 (figura 1). O Impactor é preparado na posição zero, um fio de terra é ligado à ferida e o cateter arterial é lavado com SSI. O Impactor deve ser centrado entre o fim de T9 e o início de T10. Os devidos ajustes devem ser feitos no aparelho e no programa de computador.
Uma vez ajustado o programa, a ponta do Impactor é liberada e causará a lesão. O rato deve ser então levado para um lugar aquecido, a fim de que se inspecione o local da lesão e seja feita hemostasia. O local deve ser lavado com SSI, seguido de sutura por planos (muscular e pele).
Os ratos são então mantidos numa câmara com temperatura constante por 48 horas, recebendo medicação ou placebo por via endovenosa, conforme o protocolo estabelecido. Recomenda-se que a bexiga seja esvaziada, mas não completamente, 5-6 horas após a lesão e após 24 horas; após esse período deve-se coletar amostra de urina (1-2ml), para dosagem de sódio e potássio, além de controle da excreção de medicamentos administrados ao rato. Os ratos são sacrificados seqüencialmente após a lesão e em intervalos de seis horas, até que se completem 48 horas, a fim de avaliar a progressão dos eventos após a lesão medular.
Os ratos são pesados, a bexiga é espremida, sendo o volume mensurado e 1ml armazenado para dosagem de sódio e potássio. Após anestesia com pentobarbital 50-60mg/kg EV ou intraperitoneal, o rato é decapitado e exsanguinado, coletando-se sangue num tubo de centrífuga heparinizado. Uma pequena porção do sangue deve ser transferida para uma micropipeta para mensuração de hematócrito. O sangue deve ser centrifugado e 1ml de plasma armazenado a -70ºC. Devem ser avaliadas alterações macroscópicas, com foco em cistite/ cistite hemorrágica; infarto renal, hepático, cardíaco visíveis; infecção nos locais operados; hemorragia na cavidade abdominal; edema pulmonar.
Deve-se remover a coluna vertebral de C5 a L5, retirando o máximo de músculo; esta deve ser colocada num tubo (de centrífuga) e este é selado e rotulado. As peças passam então por um processo de descalcificação, para depois ser emblocadas em parafina e coradas com hematoxilina-eosina (HE) e luxol-fast-blue (LFB), para avaliação histológica.
RESULTADOS
Após diversas dificuldades técnicas, o modelo de lesão medular experimental foi reproduzido com sucesso. Uma lesão medular padronizada foi obtida, nenhum dos ratos foi a óbito ou apresentou sinais de infecção nas 48 horas após o experimento.
Foram também estudados os efeitos da progressão da área de necrose secundária, com estudos histológicos de medulas lesadas em condições idênticas, mas analisadas em diferentes prazos pós-impacção. Isso comprovou a ocorrência de alterações progressivas, já não dependentes do impacto inicial.
A figura 2 mostra a imagem de uma medula normal, não contundida, nas colorações com hematoxilina-eosina (HE), em que os corpos neuronais apresentam tamanho e coloração normais.
A figura 3 foi obtida de cortes de medula de rato sacrificado após seis horas do trauma e mostram redução volumétrica dos neurônios e alteração em sua coloração, agora mais clara, com menos impregnação pelo corante.
A figura 4, de medula com 24 horas pós-lesão, identifica neurônios bastante reduzidos e mostra indícios de vacuolização intraneuronal.
A figura 5, obtida após 48 horas do trauma, revela maior vacuolização da área lesada, ausência de neurônios corados e intensa degeneração neuronal.
Outros cortes histológicos foram obtidos após 48 horas do trauma, do segmento medular imediatamente distal à lesão; mostram o tecido absolutamente normal, comprovando que as lesões mostradas nas figuras anteriores, das áreas lesadas, são realmente produzidas pela impacção e não por qualquer outro fenômeno. São essas lesões progressivas, chamadas de dano neurológico secundário ao trauma, que as pesquisas procuram estudar e, pela melhor compreensão das alterações fisiopatológicas, buscar tratamentos que interrompam o processo ou que possam revertê-lo.
DISCUSSÃO
Conseqüência direta do trauma, a LMT atinge principalmente uma faixa etária mais exposta a acidentes, em geral também a mais produtiva. Cerca de 60% dos casos de LMT ocorrem em pessoas entre 16 e 30 anos de idade, mas a média está aumentando com o crescimento da longevidade do ser humano, chegando aos 33 anos nesta última década.
Devido às peculiaridades econômicas brasileiras, é difícil obter dados estatísticos precisos a respeito da LMT, sendo as estimativas baseadas nas informações provenientes dos países desenvolvidos.
Nos Estados Unidos, existe desde 1937 o National Spinal Cord Injury Database, que registra informações oriundas de 21 centros federais de atendimento a pacientes com lesão medular.
Por seus dados, estima-se que a incidência anual de lesão medular traumática (LMT) está entre 30 e 40 casos novos por milhão de habitantes. Para uma população em torno de 158.000.000 de habitantes, poderíamos imaginar cerca de 6.000 casos anuais no Brasil.
A prevalência é estimada em torno de 700 casos por milhão de habitantes, o que daria uma população de 100.000 pessoas convivendo com esse problema em nosso país.
Em Curitiba, dados obtidos pelo Grupo Integrado de Apoio ao Paraplégico-Giapa, do Hospital Universitário Cajuru, mos-tram que em 119 de 240 casos nos quais foi possível determinar a causa de LMT, 42% foram vítimas de acidente de trânsito e 27% de violências que incluíam variadas formas de agressão.
O custo econômico e social para o atendimento desse volume de pessoas é assombroso, pois soma o atendimento médi-co-hospitalar de urgência ao período de reabilitação.
É universal a aceitação de dois tipos de lesão que produzem o dano neurológico. O primeiro, produzido pelo trauma em si, com morte celular e liberação de eletrólitos, metabólitos e enzimas; esse é um processo mecânico, que independe do controle celular. O segundo surge como uma cascata de fenômenos, envolvendo edema, inflamação, isquemia, reperfusão, fatores de crescimento, metabolismo do cálcio e peroxidase lipídica; essa forma particular de morte celular, apoptose, tem sido alvo de esforços científicos no sentido de obter seu controle.
Admite-se que o melhor animal para essas experiências seja o rato e que a única forma de comparar resultados é a partir de lesões padronizadas e em grande volume de espécimes.
Esses métodos de comprovada precisão, quando instalados, além de diminuir o número de animais sacrificados nos estudos, permitem a análise mais adequada dos parâmetros envolvidos na produção da lesão e em sua preparação.
As lesões medulares experimentais abertas, isto é, com exposição da medula, são as que criam as melhores condições para estudo. As lesões fechadas produzem um sem-número de fraturas cujos fragmentos alteram o curso natural que se pretende estudar.
A medula exposta diretamente pode ser seccionada ou contundida. A contusão reproduz com maior fidelidade as situações reais provocadas por traumas que ocorrem com o ser humano. Além disso, a secção pode implicar alterações liquóricas que dificultam a sobrevivência do animal.
A padronização do método de contusão medular torna-se de evidente necessidade, quando se consulta a literatura sobre o tema. Nas publicações modernas ou atuais são poucos os relatos especificamente sobre detalhes técnicos do método utilizado para produzir a lesão e as explicações são em geral breves.
CONCLUSÕES
As possibilidades de estudo no campo da lesão medular são amplas. Esse modelo experimental mostrou-se aplicável em nosso meio, sem necessidade de grandes alterações à estrutura de pesquisa já existente na maioria de nossas universidades.
Este esforço permite-nos realizar um intercâmbio com outros centros de pesquisa em lesão medular, facilitando o desenvolvimento da pesquisa básica em nosso meio e futuras contribuições à comunidade científica.
1. Allen, A.R.: Remarks on the histopathological changes in the spinal cord due to impact. An experimental study. JAMA 57: 878-880, 1911.
2. Bresnahan, J.C., Beattie, M.S., Todd III, F.D. & Noyes, D.H.: A beha- vioral and anatomical analysis of spinal cord injury produced by a feed- back-controlled impaction device. Exp Neurol 95: 548-570, 1987.
3. Ducker, T.B., Kindt, G.W. & Kempe, L.G.: Pathological findings in acute experimental spinal cord trauma. J Neurosurg 35: 700-708, 1971.
4. Eidelberg, E., Staten, E., Watkins, J.C. et al: A model of spinal cord injury. Surg Neurol 6: 35-38, 1976.
5. Falconer, J.C., Narayana, P.A., Bhattacharjee, M.B. & Liu, S.J.: Quanti- tative MRI of spinal cord injury in a rat model. MRM 32: 484-491, 1994.
6. Hung, T., Albin, M.S., Brown, T.D. et al: Biomechanical responses to open experimental spinal cord injury. Surg Neurol 4: 271-276, 1975.
7. Koozekanani, S.H., Vise, W.M., Hashemi, R.M. & McGhee, R.B.: Possi- ble mechanisms for observed pathophysiological variability in expe- rimental spinal cord injury by the method of Allen. J Neurosurg 44: 429-434, 1976.
8. Kwo, S., Young, W. & Decrescito, V.: Spinal cord sodium, potassium calcium and water concentration changes in rats after graded contusion injury. J Neurotrauma 6: 13-24, 1989.
9. Noble, L.J. & Wrathall, J.R.: Spinal cord contusion in the rat: morpho- metric analyses of alterations in the spinal cord. Exp Neurol 88: 135- 149, 1985.
10. Noble, L.J. & Wrathall, J.R.: An inexpensive apparatus for producing graded spinal cord contusive injury in the rat. Exp Neurol 95: 530-533, 1987.
11. Rivlin, A.S. & Tator, C.H.: Effect of duration of acute spinal cord com- pression in a new acute cord injury model in the rat. Surg Neurol 10: 39- 43, 1978.
