O processo de consolidação de fraturas pode ser influenciado por fatores como características da lesão (tipo, duração e intensidade do trauma), do paciente (idade, estados metabólico e nutricional, doenças e medicações associadas) e do tratamento instituído (redução, estabilização, carga e movimento)(5,6). Em relação à interferência de fármacos na reparação óssea, atualmente, aceita-se que algumas drogas atuem estimulando a consolidação óssea, como esteróides anabolizantes(5,6,25), hialuronidase(6,25), condroitina sulfato(6,25), hormônio do crescimento(5,6,25), insulina(6,25), calcitonina(6,25,29), hormônios tiroidianos(5,6,25), vitaminas A e D em doses-pa-(5-7,25), e outras atuem retardando a consolidação óssea, como corticosteróides(5,6,25), anticoagulantes(6), tiouracil(25) e vitaminas A e D em altas doses(7,25).
É consenso atual que "pacientes de risco" para o desenvolvimento de trombose venosa profunda (TVP) devam fazer a profilaxia medicamentosa(18,19,29), incluindo-se os pacientes ortopédicos(1,4,10,14,15,18,19,21,23,24), especialmente os idosos, com lesão nos membros inferiores, que ficarão longo tempo impossibilitados de deambular, independentemente da existência de outros fatores de risco para tromboembolismo(18,19).
O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da enoxaparina, uma heparina de baixo peso molecular, no processo de consolidação de fraturas.
MATERIAL E MÉTODOS
Dezesseis ratos da raça Wistar (Rattus norvegicus albinus), machos, com cinco meses de vida, foram utilizados neste estudo. Os animais foram divididos em dois grupos iguais, aleatoriamente, e submetidos à anestesia inalatória com éter sulfúrico, tendo, a seguir, suas tíbias direitas fraturadas manualmente na diáfise (junção do 1/3 médio com o 1/3 distal) pelo mesmo pesquisador (A.T.). Após a produção das fraturas, todos os animais foram pesados (balança para 11 quilogramas (kg) - Tita S.A.) e apresentaram massa média de 350 gramas (g), valor utilizado para o cálculo da dosagem da enoxaparina.
Vinte e quatro horas após a produção das fraturas foi iniciado o uso da enoxaparina sódica (Clexane®, Rhodia Far-ma), por via subcutânea, na dose de 0,857 miligramas (mg) por kg de peso por dia (0,3mg/dia), dividida em duas vezes, em oito ratos (grupo A); no grupo-controle (grupo B) foi injetado, por via subcutânea, 0,15 mililitro (ml) somente de soro fisiológico a 0,9%, duas vezes ao dia, objetivando a manipulação semelhante de todos os animais e a neutralização dessa variável.
As doses da droga foram calculadas de duas maneiras: adaptando-as para ratos com 0,350kg a partir dos esquemas usuais para adultos-padrões (70kg), por simples regra de três; e confirmando esses resultados com as doses propostas terapeuticamente em mg/kg/dia, após adaptá-las para esquema profilático.
Foi necessária a diluição da enoxaparina em soro fisiológico a 0,9% para 100 vezes, a fim de facilitar a administração.
Após a produção das fraturas, os animais foram colocados em quatro gaiolas com quatro ratos em cada, sem imobilização ou restrição de atividade e com ração padrão e água à vontade.
Os grupos A e B foram divididos em quatro subgrupos com dois animais em cada (1, 2, 3 e 4), de acordo com a época de seu sacrifício, nos quais "1" corresponde a uma semana, "2" a duas semanas, "3" a quatro semanas e "4" a seis semanas, de acordo com as fases de regeneração da fra-tura em ratos identificadas por Udupa & Prasad(32).
Os animais foram sacrificados com exsanguinação por punção cardíaca, após anestesiados inalatoriamente com éter sulfúrico. A seguir, foram preparadas peças para análise histológica e estudo através de aparelho de raios X (RX) convencional. As tíbias fraturadas foram dissecadas com seu envoltório muscular e imersas em solução de formol a 10%. Todas as peças foram submetidas à avaliação radiográfica com aparelho FNX-300, com técnica de 45Kv e 8mAs. Posteriormente foram processadas para análise por técnicas de rotina em microscopia óptica.
Após fixação com formol a 10% tamponado, os fragmentos foram descalcificados em ácido nítrico a 5% por cinco dias, desidratados, clarificados, incluídos em parafina e cortados na espessura de 5µm, sagitalmente ao plano da fratura com micrótomo Spencer (American Optical). Os cortes fo-ram corados pela hematoxilina-eosina (coloração para células e matriz extracelular), picrosirius red (coloração para colágeno fibrilar em vermelho-grená) e alcian blue pH 2,5-sa-franina (coloração para proteoglicanos ácidos não sulfatados e sulfatados em azul), de acordo com metodologias descritas por Bancroft & Cook(3).
Todos os animais tiveram 2,5ml de sangue coletados por punção cardíaca no momento do sacrifício, para dosagem do tempo de tromboplastina parcial (PTT), visando avaliar a via intrínseca da coagulação, afetada pelas heparinas(19).
RESULTADOS
Avaliação clínica
No 15º dia de experimento não havia mobilidade nos focos de fratura e os animais moviam-se em suas gaiolas apoiando normalmente com as patas fraturadas, sem diferenças entre os grupos.
Avaliação laboratorial
Nem todas as amostras de sangue coletadas puderam ser analisadas, pois algumas coagularam. Das 16 amostras obtivemos resultados em nove, ou seja, em 56,25% dos casos; em cinco foram do grupo A (enoxaparina) e quatro do B (controle).
Os ratos do grupo B apresentaram PTT médio de 18 segundos e os do grupo A, de 25,2 segundos. Logo, os animais do grupo A tiveram PTT médio 1,4 vez maior que os do gru-po-controle (tabela 1).
Avaliação radiográfica
1ª semana: não foi observada qualquer formação de calo.
2ª semana: notou-se a formação de calo, aparentemente mais extensa no grupo que fez uso de enoxaparina (grupo A).
4ª semana: presença de um calo mais exuberante e ossificado nos dois grupos, havendo uma ponte contínua unindo os dois fragmentos principais da fratura.
6ª semana: existiam sinais de remodelação nos dois grupos, aparentemente sem diferenças entre eles.
Avaliação histológica
a) Grupo A (enoxaparina)
1ª semana: entre as extremidades ósseas fraturadas obser-vou-se grande proliferação de fibroblastos, pequena quantidade de colágeno e proteoglicanos ácidos, peças cartilaginosas e osso imaturo em formação; pequena área de hematoma (união cartilaginosa e colágena).
2ª semana: o calo em formação tinha aparência heterogênea, predominantemente óssea, com grande quantidade de ossificação endocondral e osso novo, presença de linha cimentante entre o osso velho (secundário ou maduro) e o novo (primário ou imaturo), além de peças cartilaginosas e fibras colágenas. O periósteo estava espesso, sugerindo proliferação periosteal (união óssea). Houve diminuição dos proteoglicanos ácidos e aumento de colágeno (fig. 1).
4ª semana: na área central da lesão, a união óssea estava mais avançada, com trabéculas espessas em grande quantidade. Os proteoglicanos praticamente desapareceram.
6ª semana: na área central da lesão a união foi óssea; trabeculação espessa e união quase perfeita.
b) Grupo B (controle)
1ª semana: entre as extremidades ósseas fraturadas observou-se grande proliferação de fibroblastos e pequena quantidade de colágeno. Grande número de condroblastos e condrócitos com proteoglicanos ácidos presentes nas zonas laterais à área fraturada (união fibroblástica). Na área central, um pequeno hematoma e fibrina.
2ª semana: o calo em formação tinha aparência heterogênea, com presença de cartilagem, área de ossificação endocondral e osso novo. Observou-se pequena quantidade de proteoglicanos ácidos nas áreas de ossificação endocondral e nas áreas de formação de osso novo (união cartilaginosa) (fig. 2).
4ª semana: presença de osso novo e grandes áreas de ossificação endocondral (fase osteogênica).
6ª semana: na área central da lesão a união foi óssea; trabeculação espessa (em menor quantidade que no grupo A) e união quase perfeita.
DISCUSSÃO
A doença tromboembólica vem sendo motivo de preocupação há muito tempo(11). Fitts et al.(11), em 1964, fizeram um levantamento das causas de mortes violentas (por acidente, homicídio ou suicídio) ocorridas na Filadélfia em 1961 e observaram que a maioria acometeu pacientes idosos com fraturas na região do quadril. Destes, 38% tiveram suas mor-tes relacionadas diretamente com embolia pulmonar. Concluíram que o uso de anticoagulantes nesses pacientes poderia diminuir a taxa de mortalidade(11).
Desde então, diversos protocolos vêm sendo adotados para pacientes ortopédicos, em especial os que sofrem fratura do fêmur proximal(1,4,10,14,18,19,21,23,24). O arsenal terapêutico vemse reciclando rapidamente, sem existir, até o momento, esquema universalmente aceito e adotado(1). Heparinas de baixo peso molecular(4,10,12,14,17,21,24,26) e warfarina em baixas doses(8,12,13,17) estão sendo utilizadas em substituição ao esquema clássico com heparina em baixas doses(10,21), já que esta se tem mostrado ineficaz em pacientes com fraturas ao nível do quadril(1). São, segundo King(15), os dois esquemas mais efetivos atualmente na prevenção da TVP; as heparinas de baixo peso molecular têm a vantagem adicional de não precisar de controle laboratorial para ajuste da dose.
Dessa forma, utilizamos a enoxaparina em ratos analogamente ao esquema profilático usado para o humano adulto (40 a 60mg/dia(26)). Ajustamos essa dose para o peso médio dos animais utilizados na pesquisa (350g), sendo sua efetividade comprovada com os resultados laboratoriais encontrados.
Em relação aos trabalhos publicados anteriormente, observamos que não houve padronização da metodologia adotada. Foram utilizadas doses excessivas dos anticoagulantes e não houve diferenciação entre doses profiláticas e terapêuticas, além de terem sido empregados, basicamente, heparinas e dicumarol(16,20,22,24,30,31). Não foram encontrados na literatura trabalhos experimentais relacionando a enoxaparina e a consolidação de fraturas.
Em relação aos dias que escolhemos para sacrificar os animais, baseamo-nos em trabalho de Udupa & Prasad(32), que definiram quatro fases no processo de consolidação de fraturas em ratos: na 1ª semana, fase fibroblástica; na 2ª, fase colágena; na 3ª e 4ª, fase osteogênica; e na 5ª e 6ª semanas, fase de remodelação. Os trabalhos prévios utilizaram como época de sacrifício dos últimos animais de 15 dias(23) a 42 dias(9).
Acreditamos que o tempo mínimo para avaliação do processo de consolidação de fraturas em ratos adultos é de seis semanas, podendo ser até um pouco mais extenso, já que nesta época começava a surgir trabeculação mais espessa, sem diferença significativa entre os grupos.
Não observamos as complicações relatadas por alguns autores, como alterações hemorrágicas(2,23,28), com alguns casos de óbito(2,28). Os demais autores(9,20,27,31) não fizeram referências quanto a complicações.
No que diz respeito à avaliação clínica, não encontramos diferenças com os demais trabalhos(2,27,28) e, quanto à avaliação laboratorial, observamos em nosso trabalho que a enoxaparina levou a aumento no PTT, comparativamente ao do grupo-controle, comprovando sua alteração na via intrínseca da coagulação. Os resultados demonstraram que nossos objetivos em relação à anticoagulação foram alcançados.
Em relação à avaliação radiográfica, nossos resultados foram similares aos relatados nos trabalhos de Price & Williamson(27) e de Rokkanen & Slätis(28), os dois únicos a adotarem esse parâmetro de avaliação. Evidências de calo ósseo não foram observadas na 1ª semana e, a partir da 2ª semana (12 dias para Rokkanen & Slätis(28)), já foi notado calo mais exuberante nos animais tratados com anticoagulantes. Com quatro semanas já havia aspecto de união óssea nos dois grupos e, com seis semanas, de remodelação, mais avançada no grupo A (enoxaparina).
Quanto à avaliação histológica, observamos que na 2ª semana já havia união óssea no grupo A (enoxaparina), enquanto no controle a união era cartilaginosa. Na 4ª semana a união no grupo A continuou óssea e no grupo B (controle) houve padrão intermediário, com aspecto misto cartilaginoso e ósseo. Em ambos os grupos o periósteo estava espesso, denotando atividade osteogênica. Dessa forma, nessa etapa, pode-se dizer que, de maneira geral, em relação ao grupocontrole (B), os animais do grupo A apresentaram tanto a fase cartilaginosa quanto a fibroblástica mais rápidas. Na 6ª semana ocorreu união óssea nos dois grupos; em ambos estava presente trabeculado mais espesso (maior quantidade no grupo A). Houve redução de positividade para proteoglicanos ácidos em todos os grupos, principal e precocemente nos animais em que foi administrada enoxaparina. Logo, com seis semanas ocorreu consolidação óssea em todos os ratos, com aspecto de maturidade em ambos os grupos. Não sabemos, contudo, se essa estimulação (no A) em fases intermediárias de formação de calo é significativa quando extrapolada para a prática clínica.
A despeito das análises de Udupa & Prasad(32), que relata-ram maior quantidade de proteoglicanos ácidos na 1ª fase de reparação, em nossas observações o pico dessas substâncias ocorreu na 4ª semana. No entanto, nossa avaliação foi pura-mente histoquímica (alcian blue - safranina), enquanto a dos autores supracitados foi bioquímica com dosagens diretamente das peças, após preparo adequado.
Stinchfield et al.(31) observaram diminuição marcante na quantidade de mucopolissacarídeos nos animais que receberam drogas anticoagulantes. Justificaram seus resultados explicando que a heparina, por ser proteoglicano ácido sulfatado, pode competir com os teciduais, evitando a calcificação da matriz óssea. Além disso, a diminuição observada no número de células no sítio da lesão talvez fosse decorrente do efeito tóxico das drogas(31).
Fazendo referência ao trabalho de Udupa & Prasad(32), achamos que as denominações mais adequadas para a 2ª e 4ª fases de consolidação das fraturas em ratos seriam "fibrocartilaginosa" e "de ossificação com osso imaturo", respectivamente, em vez de "colágena" e "de remodelação". Isso porque, em nossas observações, na 2ª fase ocorreu maior predomínio de condroblastos em relação aos fibroblastos, com grande número de peças cartilaginosas. Já na 4ª fase notamos quantidades importantes de osso imaturo com ausência de osteoclastos, que deveriam estar presentes durante a remodelação.
Outros autores também denominaram a 2ª fase de cartilaginosa(2,9,20,22,28), tendo observado alterações qualitativas e quantitativas modestas na formação do calo em animais em que foram administradas drogas anticoagulantes. No entanto, Minola et al.(20) definiram essa fase cartilaginosa como "desvio do normal", do que discordamos, pois, mesmo no grupo-controle (B), ela esteve presente e bem definida. Já Aulisa(2) comentou que as alterações qualitativas foram insignificantes, do que também discordamos, pois estiveram presentes em todas as fases (do ponto de vista histológico).
À exceção de Stinchfield et al.(31), não foi observado nenhum caso de pseudartrose em animais submetidos à terapia anticoagulante(2,9,20,22,27,28,33).
Finalmente, nossos resultados não nos permitem afirmar que as alterações observadas em fases intermediárias da formação do calo ósseo em ratos (positivamente no caso da enoxaparina em relação ao grupo-controle) sejam relevantes clinicamente. Ademais, na avaliação clínica dos ratos não notamos diferenças entre os grupos (apesar de esta avaliação não ser muito sensível pelas próprias características dos animais) e com seis semanas observamos união óssea em todas as peças quando avaliadas histologicamente.
CONCLUSÕES
1) A enoxaparina estimulou a formação do calo (em fases intermediárias de sua formação).
2) As avaliações clínica, radiográfica e histológica demonstraram que ocorreu união óssea em todos os animais com seis semanas após as fraturas, sem diferença relevante entre os grupos.
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