A resposta do osso ao trauma consiste de uma seqüência ordenada e bem diferenciada de eventos, que resulta na cicatrização do tecido lesado de forma bastante semelhante à sua estrutura inicial(1-3). Embora em condições normais a maioria das fraturas não apresente problemas de consolidação, existem algumas situações em que o processo de reparo pode ser acelerado, assegurando rápido retorno da função músculo-esquelética(4-7). Diante desta perspectiva, o conhecimento de métodos que estimulem a consolidação de fratura adquire considerável importância(7,8).
Recentemente, alguns estudos têm sido conduzidos com o objetivo de verificar o papel do laser (light amplification by stimulated emission of radiation) de baixa energia (LBE) no processo de consolidação de fratura(9-13). Os resultados, no entanto, são controversos. Barushka et al(9), em 1995, investigaram o efeito do LBE (hélio-neônio [He-Ne]) sobre o reparo ósseo em tíbias de ratos, usando métodos bioquímicos e análise histomorfométrica do calo. Observaram que nos animais irradiados com o laser He-Ne ocorreu mudança na relação osteoblastos:osteoclastos e acúmulo mais rápido de matriz osteóide no local da lesão provocada. Yaakobi et al(13), em 1996, estudaram o efeito do laser He-Ne no reparo do osso cortical de tíbias de ratos através de métodos bioquímicos e radioativos. Concluíram que o processo de reparo ósseo cortical em tíbias de ratos é marcadamente acelerado pela irradiação com este tipo de laser. No entanto, David et al(10), em 1996, mostraram que o uso do laser He-Ne não estimulou a consolidação de fratura de tíbias de ratos. Estes autores estudaram o calo ósseo radiográfica, histológica e biomecanicamente, e seus resultados divergiram dos achados de Barushka et al e Yaakobi et al(9,13).
O objetivo dos autores com o presente estudo foi observar bioquímica e histologicamente os efeitos do laser He-Ne sobre o processo de consolidação de fraturas fechadas e não imobilizadas de tíbias de ratos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 39 ratos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus), adultos, fêmeas, pesando em média 300 gramas. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos, denominados A e B, e tiveram sua tíbia direita fraturada manualmente, de forma fechada, na região diafisária média, sob anestesia geral inalatória (éter)(14, 15). As fraturas não foram imobilizadas e os animais não sofreram restrição quanto à mobilidade. Os animais foram mantidos em local apropriado, colocados em gaiolas adequadas e receberam água e ração padrão ad libitum. O grupo A (laser He-Ne) foi constituído de 21 animais e o grupo B (sham), de 18 animais.
No dia seguinte ao da realização das fraturas, iniciou-se protocolo terapêutico com o laser He-Ne. Foi utilizado um aparelho emissor hélio-neon KC 609 V R (Kroman, São Paulo), com 10mW de potência contínua, 670nm de comprimento de onda (visível em vermelho) e 5mm2 de diâmetro de irradiação. Cada animal do grupo A recebeu irradiação do laser com 6J de densidade de energia radiante, durante dois minutos, com aplicação do tipo de contato, sobre o foco de fratura. As sessões foram realizadas de dois em dois dias. A escolha deste esquema baseou-se em estudos previamente realizados(10,12). O grupo B (grupo sham) foi estudado segundo a mesma metodologia do grupo A, à exceção do uso do laser He-Ne. Para que fossem controladas possíveis diferenças devidas a este fato, todos os animais do grupo sham foram manipulados como se estivessem recebendo o tratamento, estando o aparelho de laser desligado (0J).
Os animais foram dessangrados por punção cardíaca(16) nas 2ª, 3ª e 5ª semanas após a produção das fraturas. Fo-ram colhidas amostras de sangue em quantidade suficiente para realização de estudo bioquímico, com dosagens de fosfatase alcalina, cálcio e fósforo. Além disso, os ratos tiveram suas tíbias direitas dissecadas, limpas de seu envoltório muscular, preservando-se a integridade do calo ósseo, e estudadas histologicamente, através de microscopia de luz. As tíbias fraturadas foram fixadas em solução tamponada de paraformaldeído, descalcificadas em líquido de Perini, incluídas em parafina e coradas pelas técnicas de hematoxilina e eosina (H/E) e tricrômico de Mas-son. A avaliação histológica foi realizada sempre pelo mesmo pesquisador, de forma aleatória e cega.
Os resultados dos exames laboratoriais foram analisados estatisticamente utilizando-se o teste t de Student, com nível de significância a = 0,05(17).
RESULTADOS
A análise histológica do calo não demonstrou alterações qualitativas e quantitativas capazes de diferenciar os grupos entre si. Com duas semanas de fratura havia a presença de peças cartilaginosas e de osso imaturo recém-forma-do, com predomínio ainda de células mesenquimais. Trabéculas ósseas melhor definidas passaram a ser observadas entre a segunda e a terceira semanas após as fraturas, sem diferença entre os grupos. A união entre as extremidades ósseas fraturadas tornou-se bastante evidente na quinta semana, embora não fosse possível notar qualquer efeito de remodelação neste período. Em ambos os grupos as trabéculas ósseas neoformadas eram de aspecto grosseiro e irregular; não foi observada a presença de osteócitos.
Os dados da análise laboratorial encontram-se nas tabelas 1, 2 e 3. Não houve perda de nenhuma amostra de sangue colhida, tendo sido dosados fosfatase alcalina, cálcio e fósforo. Utilizando-se o teste t de Student com nível de significância de 5%, não foi possível encontrar diferença estatisticamente significativa entre os resultados dos grupos estudados (p > a = 0,05).
DISCUSSÃO
As aplicações do laser na medicina têm aumentado nos últimos anos. Desde sua concepção, na década de 60, di-versos tipos de aparelhos com diferentes fontes de luz vêm sendo estudados, tendo como princípios as reações fototérmicas e fotoablativas do laser com os tecidos(18-20). Mester et al(21) foram os primeiros a demonstrar as possíveis aplicações clínicas dos efeitos atérmicos da luz do laser nos mais variados tecidos. Estes autores observaram que o uso de intensidades relativamente baixas (menores que 500mW) é capaz de modular determinados processos biológicos, em especial a fotobioestimulação do processo de cicatrização tissular(22). Estudos posteriores utilizando lasers de baixa energia confirmaram os achados de Mester et al(9,11-13,21-28).
O laser He-Ne é um dos tipos de LBE mais usados atualmente. Tem como meio ativo o gás neônio, apresentando quatro importantes comprimentos de onda(28). Seu mecanismo de ação baseia-se na excitação em cadeia dos átomos de neônio e de hélio, provocada pela colisão com uma descarga de elétrons(29). Este fenômeno produz uma luz visível e vermelha que penetra nos tecidos sem divergência até 0,9mm abaixo da pele. Acredita-se que aproximadamente mais da metade de sua energia seja absorvida pelas estruturas aí localizadas(28).
Neste estudo utilizou-se o laser He-Ne com o objetivo de observar seus efeitos sobre o processo de consolidação de fratura. A exemplo de experimentos anteriores(14,15,30), os autores produziram fraturas fechadas e não imobilizadas em tíbias de ratos Wistar. Foi usado um aparelho emissor com 10mW de potência contínua, 670nm de comprimento de onda (visível em vermelho) e 5mm2 de diâmetro de irradiação. A técnica utilizada foi a de contato, irradian-do-se o laser em ângulo de 90 graus, com 6J de densidade de energia radiante, durante dois minutos, de dois em dois dias. Esta metodologia foi previamente descrita por David et al(10) e por Trelles e Mayayo(12) em investigações semelhantes. Veçoso(31) sugeriu esquema de tratamento similar em seres humanos.
Os resultados foram avaliados com testes bioquímicos e microscopia de luz. Yaakobi et al(13) e Barushka e Oron(32) demonstraram elevação significativa da fosfatase alcalina em ratos submetidos ao tratamento com laser He-Ne. Indiretamente, estes autores atribuíram tal fato à presença de maior população de células de linhagem osteogênica no calo ósseo. Sabe-se que a fosfatase alcalina é um bom marcador da formação óssea. Entretanto, outras condições, além do processo de consolidação de fratura, podem levar à elevação desta enzima. Estudos utilizando a fosfatase alcalina específica do osso ou proteínas não-colágenas, como ostocalcina (bone Gla-protein) e osteopontina, certamente seriam mais úteis em experimentos sobre o processo de reparo ósseo. Em nosso estudo, embora não tenhamos dosado a fosfatase alcalina específica do osso, não observamos diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos. Além disso, não ocorreu perda de nenhum animal durante toda a parte experimental do projeto, o que indiretamente parece assegurar que os cobaias empregados eram sadios.
A dosagem de cálcio foi realizada com o intuito de observar o comportamento deste íon durante as diferentes fases do processo de consolidação avaliadas nesta pesquisa e sua íntima relação de equilíbrio com o fosfato. Barushka e Oron mostraram aumento do íon cálcio no calo de animais irradiados com este LBE(32). No presente estudo não houve diferença estatisticamente significativa nas dosagens de cálcio e fosfato nos dois grupos utilizados. Histologicamente, realizou-se análise quantitativa e qualitativa do tecido neoformado nas 2ª, 3ª e 5ª semanas após a produção das fraturas. Estas datas correspondem, respectivamente, às fases fibrocartilaginosa, cartilaginosa e de ossificação com osso imaturo, segundo modificação proposta por Giordano et al(14) para a descrição original das fases do processo de consolidação de fratura de tíbia de ratos feita por Udupa e Prasad(30) em 1963. Dessa forma, foi possível estudar o processo de reparo ósseo na vigência ou não do laser.
Os resultados obtidos neste trabalho foram incapazes de evidenciar aceleração do processo de osteogênese em animais submetidos à terapia com laser. As avaliações laboratorial e histológica não demonstraram diferenças entre os grupos A e B. David et al(10), através de estudos radiográfico, histológico e biomecânico, obtiveram achados idênticos. Contrariamente, outros experimentos mostraram ação de estímulo ao mecanismo de reparo ósseo com o uso de LBE(9,11-13,31). Apesar disso, a escassa literatura e a falta de estudos moleculares acerca deste assunto não permitem a indicação dos lasers de baixa energia como método auxiliar no tratamento das fraturas(8,33).
Concluímos que, nas condições estudadas, o laser He-Ne não acelera o processo de consolidação óssea em fraturas fechadas e não imobilizadas de tíbias de ratos Wistar.
AGRADECIMENTOS
Aos Professores Radovan Borojevic e Katia Arcanjo (Departamento de Histologia e Embriologia), Maria de Fátima Carvalho Pereira (Serviço de Patologia Clínica).
1. Junqueira L.C., Carneiro J., Kelley R.O.: "Bone" in Basic histology. Stanford, Appleton & Lange, p.p. 132-151, 1995.
2. Day S.M., Ostrum R.F., Chao E.Y.S., Rubin C.T., Aro H.T., Einhorn T.A.: "Bone injury, regeneration, and repair" in Buckwalter J.A., Einhorn T.A., Simon S.R.: Orthopaedic basic science. Chicago, AAOS, p.p. 371-399, 2000.
3. Buckwalter J.A., Cruess R.L.: "A cura dos tecidos músculo-esqueléticos" in Rockwood C.A., Jr., Green D.P., Bucholz R.W.: Fraturas em adultos. São Paulo, Manole, p.p. 179-219, 1993.
4. Connolly J.F.: Injectable bone marrow preparation to stimulate osteo- genic repair. Clin Orthop 313: 8-18, 1995.
5. Delgado-Martínez A.D., Martínez M.E., Carrascal M.T., Rodríguez-Avial M., Munuera L.: Effect of 25-OH-vitamin D on fracture healing in eld- erly rats. J Orthop Res 16: 650-653, 1998.
6. Hadjiargyrou M., McLeod K., Ryaby J.P., Rubin C.: Enhancement of fracture healing by low intensity ultrasound. Clin Orthop 355: 216-229, 1998.
7. Stevenson S.: Enhancement of fracture healing with autogenous and al- logeneic bone grafts. Clin Orthop 355: 239-246, 1998.
8. Cavallo R.J., Einhorn T.A.: "Enhancement of skeletal repair" in Brow- ner B.D., Jupiter J.B., Levine A.M., Trafton P.G.: Skeletal trauma. Philadelphia, W.B. Saunders, p.p. 703-718, 1998.
9. Barushka O., Yaakobi T., Oron U.: Effect of low-energy laser (He-Ne) irradiation on the process of bone repair in the tibia. Bone 16: 47-55, 1995.
10. David R., Nissan M., Cohen I., Soudry M.: Effect of low-power He-Ne laser on fracture healing in rats. Lasers Surg Med 19: 458-464, 1996.
11. O'Donnell R.J., Deutsch T.F., Flotte T.J., et al: Effect of Er:YAG laser holes on osteoinduction in demineralized rat calvarial allografts. J Or- thop Res 14: 108-113, 1996.
12. Trelles M.A., Mayayo E.: Bone fracture consolidates faster with low- power laser. Lasers Surg Med 7: 36-45, 1987.
13. Yaakobi T., Maltz L., Oron U.: Promotion of bone repair in the cortical bone of the tibia in rats by low energy laser (He-Ne) irradiation. Calcif Tissue Int 59: 297-300, 1996.
14. Giordano M., Tamanini A., Giordano V., Neto, et al: Influência da eno- xaparina na consolidação das fraturas: estudo experimental em ratos. Rev Bras Ortop 34: 208-213, 1999.
15. Giordano V., Giordano M., Knackfuss I.G., et al: Influência do tenoxi- cam no processo de consolidação de fratura de tíbia. Estudo experimen- tal em ratos. Rev Bras Ortop 34: 395-400, 1999.
16. Close B., Banister K., Baumans V., et al: Recommendations for eutha- nasia of experimental animals: Part 1. Lab Anim 30: 293-316, 1996.
17. Knapp R.G., Miller M.C., III: Clinical Epidemiology and Biostatistics. Baltimore, Williams & Wilkins, p. 275, 1992.
18. Kollmer C.: "Laser delivery systems" in Sherk H.H.: Lasers in ortho- paedics. Philadelphia, Lippincott, p.p. 7-21, 1990.
19. Peltier L.F.: The classic. A preliminary note on a new surgical-current generator. Clin Orthop 310: 3-5, 1995.
20. Dew D.K.: Laser biophysics for the orthopaedic surgeon. Clin Orthop 310: 6-13, 1995.
21. Mester E., Mester A.F., Mester A.: The biomedical effects of laser appli- cation. Lasers Surg Med 5: 31-39, 1985.
22. Mester A.F., Mester A.: Wound healing. Laser Therapy 1: 7-15, 1989.
23. Bibikova A., Belkin V., Oron U.: Enhancement of angiogenesis in regenerating gastrocnemius muscle of the toad (Bufo viridis) by low-ener- gy laser irradiation. Anat Embryol 190: 597-602, 1994.
24. Boulton M., Marshall J.: He-Ne laser stimulation of human fibroblast proliferation and attachment in vitro. Lasers Life Sci 1: 125-134, 1986.
25. Castro D.J., Abergel R.P., Meeker C., Dwyer R.M., Lesavoy M.A., Uit- to J.: Effects of Nd:Yag laser on DNA synthesis and collagen production in human skin fibroblast cultures. Ann Plast Surg 11: 214-222, 1983.
26. Hallman H.O., Basford J.R., O'Brien J.F., Cummins L.A.: Does low energy He-Ne laser irradiation alter in vitro replication of human fibro- blasts? Lasers Surg Med 8: 125-129, 1988.
27. Lyons R.F., Abergel R.P., White R.A., Dwyer R.M., Castel J.C., Uitto J.: Biostimulation of wound healing in vivo by helium-neon laser. Ann Plast Surg 18: 47-50, 1987.
28. Uppal G.: "Cold lasers" in Sherk H.H.: Lasers in orthopaedics. Phila- delphia, Lippincott, p.p. 191-196, 1990.
29. Yamanaka N., Nakazawa M., Sakasai K., Kakuta T., Yamagishi H., Ka- tagiri M.: Analysis of nuclear pumped lasing mechanism for application to nuclear radiation measurements. Nuclear Inst Methods Phys Res 389A: 513-522, 1997.
30. Udupa K.N., Prasad G.C.: Chemical and histochemical studies on the organic constituents in fracture repair in rats. J Bone Joint Surg [Br] 45: 770-779, 1963.
31. Veçoso M.C.: "Laser em traumatologia" in Laser em fisioterapia. São Paulo, Lovise, p. 65, 1993.
32. Barushka O., Oron U.: Enhancement of bone repair in an in vivo exper- imental model in the rat by low energy laser irradiation. Calcif Tissue Int 52: 590, 1993.
33. Giordano V., Giordano M., Knackfuss I.G.: Fatores de crescimento e diferenciação ósseos: presente e futuro. Rev Bras Med 57: 1018-1029, 2000.
