1. Membro titular da SBOT.
2. Professor Adjunto da Disciplina de Ortopedia e Traumatologia do Hospital Universitário Regional do Norte do Paraná - Universidade Estadual de Londrina (PR).
3. Professor Associado de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
4. Professor Assistente da Disciplina de Ortopedia e Traumatologia do Hospital Universitário Regional do Norte do Paraná - Universidade Estadual de Londrina (PR).
Endereço para correspondência (Correspondence to): Ivan J. Blume de Lima Domingues - HURNP - Depto. de Clínica Cirúrgica, Rua Robert Koch, 60 - Vila
Operária - 86038-440 - Londrina, PR. Tel.: (43) 3371-2269; fax: (43) 3337-7495; e-mail: blume61@sercomtel.com.br
A ipriflavona (7-isopropóxi-isoflavona), um derivado não hormonal das isoflavonas(1), é utilizada para prevenção e tratamento da osteoporose. Produz retenção de cálcio no organismo pela redução de osteoclastos e células mononucleadas e inibe a reabsorção óssea(2,3,4), provavelmente pelo controle do recrutamento pré-osteoclasto. Foi também demonstrado que esse medicamento estimula a síntese de colágeno em culturas de tecido(3,4) e não apresenta nenhuma atividade estrogênica intrínseca(5).
De acordo com Guarniero et al(6,7), o processo de consolidação óssea é prejudicado pela desnutrição protéica. Com o intuito de promover a melhoria da formação do calo ósseo, tendo em vista que a ipriflavona é utilizada em pacientes com osteoporose, que apresentam maior risco de sofrer fraturas, administrou-se experimentalmente a droga em ratas nutridas e desnutridas submetidas a fraturas da tíbia, com o objetivo de avaliar a formação do calo ósseo através dos seguintes parâmetros: evolução ponderal, clínico, radiográfico, densitométrico e histológico.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital Universitário Regional do Norte do Paraná - Universidade Estadual de Londrina (HURNP-UEL). Foram utilizadas 40 ratas albinas de linhagem Wistar, fêmeas, adultas, numeradas de um a 40, com peso inicial variando entre 222 e 334 gramas, divididas aleatoriamente em quatro grupos de 10, submetidas a dietas protéica e aprotéica, com ou sem administração da ipriflavona.
O grupo I foi submetido a dieta aprotéica padronizada para desnutrição experimental, sem administração do medicamento durante seis semanas(8).
O grupo II foi submetido a dieta protéica consistindo de ração padronizada comercial Nuvilab® CRU para alimentação de ratos de laboratório, baseado em recomendações do National Research Council e National Institute of Health - EUA, também sem receber medicação.
O grupo III recebeu dieta aprotéica e a ipriflavona através de técnica de gavagem, diariamente na dose de 12,5mg/100g/ dia(9) a partir do 15o dia.
O último grupo (grupo IV) recebeu dieta convencional e ipriflavona (12,5mg/100g/dia) por técnica de gavagem a partir do 15o dia.
No 15o dia as ratas foram submetidas a fratura fechada do terço médio da tíbia esquerda por flexão manual sob anestesia por inalação de éter etílico.
Os animais foram sacrificados por meio de superdosagem de anestésico, 28 dias após a fratura.
O material de estudo foi avaliado de acordo com a evolução ponderal, sendo to-dos os animais pesados no primeiro dia do experimento, no dia da realização da fratura e no dia do sacrifício. Após o sacrifício, foi realizada a dissecção da pata traseira esquerda das ratas e as peças foram radiografadas em ântero-posterior e perfil com mamógrafo Emic 200 (figura 1); procedeu-se também à medição direta, em milímetros, dos calos ósseos utilizando-se escalímetro Trident ME-15/1.
A densidade mineral óssea das peças foi medida por meio de densitômetro modelo Lunar DPX, com programa específico para pequenos animais, com unidade de medida de grama por centímetro quadrado.
Foi realizada avaliação manual da movimentação nos focos de fratura nas patas após a ablação das mesmas. Em uma escala de zero a dois, as fraturas foram graduadas, segundo Heard et al, em: grau 0 quando consolidada, grau 2 quando havia mobilidade franca e grau 1, a mobilidade intermediária(10).
Procedeu-se à avaliação histológica do calo ósseo com o objetivo de verificar os tecidos fibroso, cartilaginoso e ósseo presentes. A qualificação dos diversos tipos de tecido do calo ósseo foi realizada através de microscopia óptica, com os cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina (HE), e aumento de 200 vezes. Os resultados da densitometria, peso e área do calo ósseo foram analisados estatisticamente pelos testes t de Student e ANOVA, sendo considerados significantes valores abaixo do quinto percentil (p < 0,005).
RESULTADOS
Em relação ao peso dos animais, constataram-se durante o experimento diferenças significativas (p = 0,002) entre os grupos nutridos e desnutridos, com perda maior nos grupos I e III, submetidos a dieta aprotéica (tabelas 1 e 3).
Foi significante (p = 0,00015), no estudo radiográfico, a diferença entre os resultados médios obtidos do calo ósseo, que se apresentaram com maior área nas amostras dos grupos com dieta protéica (tabelas 2 e 4).
Constatamos na avaliação clínica do calo ósseo que as amostras submetidas a dieta protéica obtiveram melhor consolidação, quando comparadas às amostras dos grupos de dieta aprotéica. Com relação ao uso da ipriflavona, não foi observada diferença (tabelas 3 e 4). O resultado clínico, por se tratar de avaliação possível de influência subjetiva, não foi submetido a análise estatística.
Na avaliação densitométrica das amostras os resultados médios obtidos em cada grupo não tiveram diferença significativa (p = 0,146) (tabelas 1 a 4).
Quanto à histologia, ao analisarmos a relação entre cartilagem, tecido fibroso e osso neoformado nos diferentes grupos, verificou-se que nos com dieta protéica (figuras 2 e 3) houve melhor formação do calo ósseo com presença de tecido cartilaginoso e osso neoformado, quando comparado com os grupos com dieta aprotéica (figuras 4 e 5). Constatou-se, também, que no grupo aprotéico que recebeu a ipriflavona (figura 5) houve maior aparecimento de focos de cartilagem hialina e de tecido ósseo neoformado, quando comparado com amostras do mesmo grupo de dieta que não recebeu o medicamento (figura 4), apresentando maior área de tecido fibroso.
DISCUSSÃO
Escolhemos o rato como animal de experiência pela facilidade tanto do manuseio como no seu acondicionamento em gaiolas, sem imobilidade e em atividade bem próxima da normalidade. A perda ponderal nos grupos aprotéicos evidenciou a indução da desnutrição desejada.
Concordamos com os estudos de Park(11) e Herbsman et (12), que demonstraram que animais submetidos a desnutrição protéica sofrem sacrifício de tecido ósseo na economia orgânica em prol de órgãos mais importantes na manutenção da vida, ratificando que em situação metabólica desfavorável o tecido ósseo cessa o seu crescimento. Segundo Aro et al(13), esse fato pode ser avaliado radiograficamente por meio da mensuração do calo ósseo. Nossa pesquisa ratificou tal constatação.
Não concordamos com Collona(14), Moore(15) e Rodrigues(16), que relataram não haver dados consistentes da interferência da desnutrição protéica na evolução da formação do calo ósseo. Em nosso estudo, na avaliação clínica, constatamos maior consistência no calo ósseo dos animais nutridos, quando comparados com os desnutridos, conforme previamente afirmado por Guarniero et al(6,7).
Discordamos de Santana(17), que encontrou dados consistentes da interferência da desnutrição protéica na densidade mineral óssea. Em nosso estudo, na avaliação densitométrica, os resultados obtidos não foram significativos quando analisados estatisticamente (p > 0,05). Tampouco houve diferença estatística entre os grupos submetidos ao uso da ipriflavona quando comparados com os que não a receberam, sugerindo que esse medicamento não interferiu na densidade mineral óssea.
Civitelli(3), em seu trabalho sobre os efeitos da ipriflavona na formação óssea em ratos, observa que esse medicamento promove maior deposição de matriz mineral óssea. Isso também foi observado em nosso trabalho, visto que no grupo aprotéico houve maior neoformação óssea nas amostras que receberam o medicamento e no estudo histológico foi identificada maior área de cartilagem e de osso neoformado, quando comparado com o mesmo grupo de dieta que não recebeu o medicamento.
CONCLUSÕES
1) No grupo de animais com dieta protéica, a ipriflavona não interferiu no processo de consolidação da fratura.
2) No grupo de animais com dieta aprotéica, a ipriflavona melhorou o padrão histológico e o tamanho do calo ósseo.
3) A ipriflavona não modificou a densidade mineral óssea nos animais do presente estudo, independente de seu estado nutricional.
2. Kitatani K., Morii H.: Ipriflavone. Nippon Rinsho 56:1537-1543, 1998.
3. Civitelli R.: In vitro and in vivo effects of ipriflavona on bone formation and bone biomechanics. Calcif Tissue Int 61: 12-14, 1997.
4. Canonico P.L.: Effeti di Ipriflavone sul riassorbimento e la sintesi ossea. In: rd International Symposium on Osteoporosis, Copenhagen, 1990.
5. Melis G.B., Paoletti A.M., Cagnacci A., et al: Lack of any estrogenic effect of Ipriflavone in postmenopausal women. J Endocrinol Invest 15: 755-761, 1992.
6. Guarniero R., Barros T.E.P., Zerbini C.A.F., Rodrigues C.J.J., Pedrinelli Corsato M., Reis P.R.: Estudo da consolidação de fraturas na desnutrição protéica: trabalho experimental com o uso da calcitonina em ratos desnutridos [monografia]. São Paulo: Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 1989.
7. Guarniero R., Barros T.E.P., Tannuri U., Rodríguez C.J., Rossi J.D.M.B.A.: Study of fracture healing in protein malnutrition. Rev Paul Med 110: 63-68, 1992.
8. Modolin M.L.A., Bevilacqua R.G., Margarido N.F., Lima-Gonçalves E.: Cicatrização das feridas abertas na desnutrição com hipoproteinemia. Rev Hosp Clin Fac Med São Paulo 37: 275-278, 1982.
9. Bonucci E.: Ipriflavone inhibits osteoclast differentiation in parathyroid transplanted parietal bone of rats. Calcif Tissue Int 50: 314-319, 1992.
10. Heard C.W., Griffith R.B., Dudrick S.J.: The effects of nutrition on fracture healing. Orthop Trans 6: 102, 1982.
11. Park E.A.: The imprinting of nutritional disturbances on the growing bone. Pediatrics 33: 815-862, 1964.
12. Herbsman H., Kwan K., Shaftan G.W., Gordon B., Fox L.M., Enquist I.F.: The influence of systemic factors on fracture healing. J Trauma 6: 75-85, 1996.
13. Aro H., Eerola E., Aho A.J.: Determination of callus quantity in 4-week-old fractures of the rat tibia. J Orthop Scand 3: 101-108, 1985.
14. Colonna P.C.: "Pathology and repair of fractures". In: Davis L.: Christo-pher's textbook of surgery, 7th ed., Saunders, p. 992, 1960.
15. Moore F.D.: "Nutrição cirúrgica: parenteral e oral". In: Randall M.F., Hardy J.D., Moore F.D.: Manual de cuidados pré e pós-operatórios. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, p. 38-42, 1969.
16. Rodrigues R.L.: Influência da desnutrição energético-protéica na formação do calo ósseo: estudo histológico. Rev Bras Ortop 27: 435-440, 1992.
17. Santana P.J.: Estudo da consolidação de fraturas na desnutrição protéica: trabalho experimental com o uso de alendronato em ratos [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 1999.
