AVALIAÇÃO FUNCIONAL E HISTOLÓGICA DO REPARO DE NERVO CIÁTICO UTILIZANDO COLA DE FIBRINA E SUTURA EM RATOS WISTAR

Grandes avanços foram conseguidos no tratamento das lesões graves dos nervos periféricos devido ao maior conhecimento sobre sua fisiologia e ao desenvolvimento de técnicas como a microcirurgia. As reconstruções podem ser realizadas por meio de suturas perineurais, epineurais e epiperineurais(1). Muitos casos, entretanto, não evoluem satisfatoriamente, o que estimula a pesquisa nesta área. Vários relatos citados na literatura sobre o uso da cola de fibrina autógena como agente hemostático e tecido adesivo incentivaram a sua avaliação em reparo de nervos periféricos(2).

Apesar do progresso nas técnicas microcirúrgicas e da ampliação do conhecimento da regeneração nervosa, a recuperação funcional pós-reparo da transecção nervosa em ratos permanece sem avaliação precisa. Métodos tradicionais para essa avaliação, como a eletrofisiologia e a histomorfometria, são usados em grande escala, porém falham quando correlacionados com a recuperação sensitivomotora. Parâmetros da eletrofisiologia tais como velocidade de condução nervosa, pico da amplitude do potencial de ação e potencial de ação muitas vezes conduzem à interpretação inapropriada do retorno fun-cional(3).

Segundo Tetick et al, De Medinacelli descreveu, em 1982, um método quantitativo de análise da função motora do nervo ciático em ratos, baseado na interpretação de diversas medidas das pegadas do animal testado. O método conhecido como índice da função ciática (SFI) permite a avaliação funcional, por meio não invasivo, do grau de recuperação das lesões nervosas(4).

O presente estudo tem por objetivo verificar o resultado do reparo pela aplicação de cola de fibrina em comparação com a sutura epineural e a associação entre sutura epineural e cola de fibrina, nas lesões produzidas por transecção do nervo ciático, avaliação feita por meio de estudos histológicos e funcionais.

MATERIAL E MÉTODOS

Delineamento experimental
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Experimental do HMAC, conforme Protocolo 08/02. Durante sua execução foi observada a normatização proposta em: Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, Lei Federal no 6.638, de 1979*.

Descrição da amostra
Utilizaram-se 30 ratos (Rattus norvegicus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, com idade entre 110 e 150 dias e peso entre 253 e 341g. Os animais foram separados em quatro grupos: grupo S - submetidos ao reparo de nervo ciático pelo uso de sutura, com três pontos eqüidistantes (n = 10); grupo SC - submetidos ao reparo de nervo ciático pelo uso de sutura, com dois pontos, associada à cola de fibrina (n = 10); e grupo C - submetidos ao reparo de nervo ciático pelo uso de cola de fibrina (n = 10).

Ambiente de experimentação
Este estudo foi realizado nas dependências da CEP-HMAC. Os ratos foram acondicionados em grupos de cinco, em caixas de polipropileno, adequadas para a espécie, devidamente identificadas e cada animal também identificado com marcas permanentes feitas na pelagem. Foram mantidos em ambiente específico, com temperatura e umidade controladas e ciclos claro/escuro automaticamente regulados em 12 por 12 horas, receberam ração específica para a espécie (Nuvilab, Nuvital®) e água à vontade. Os dejetos e as caixas dos animais eram substituídos a cada 48 horas.

Procedimento cirúrgico

Os animais foram anestesiados com hidrato de cloral, na dose de 300mg/kg de peso corporal, conforme descrito por Bacelar(5).

A seguir, os ratos eram tricotomizados na região glútea direita, degermados com polivinilpirrolidona-iodo (Povidine®) e fixados em pranchas cirúrgicas por meio de fitas adesivas. Incisão póstero-medial através do músculo glúteo máximo do membro posterior direito permitia o acesso ao nervo ciático. O nervo era seccionado com microtesouras a 1cm proximal à sua trifurcação em sural, fibular e tibial.

O reparo da lesão nervosa foi sempre executado pelo mesmo cirurgião, sob magnificação óptica com instrumental microcirúrgico utilizando cola de fibrina (fig. 1) e ou fio mononáilon 10.0 (fig. 2).

Em todos os ratos, após o reparo do nervo, a ferida cirúrgica foi suturada com fio mononáilon 3.0, e os ratos foram mantidos por 16 semanas, nas condições ambientais anteriormente descritas.

Avaliação funcional
A avaliação funcional foi realizada utilizando a walking track analysis, descrita por De Medinacelli em 1982, citado por Tetick et al(4). Nesse teste o animal era colocado em um corredor de madeira com acesso a um ambiente escuro. Sobre o corredor foi colocada uma tira de papel de igual largura, estando o rato a ser testado com suas patas traseiras marcadas com tinta. A seguir, o animal era solto no início do corredor, por onde caminhava em direção ao ambiente escuro, deixando impressas as marcas de suas patas traseiras. Todos os ratos foram primeiramente avaliados por duas passagens pelo corredor (fig. 3), permitindo a sua adaptação e exploração do local, bem como o registro da normalidade de cada rato, antes dos procedimentos cirúrgicos.

O teste foi realizado após a cirurgia, com quatro, 12 e 16 semanas. Foram registrados com paquímetros em papel (fig. 4) as seguintes medidas: 1) do espaço entre a segunda e a quarta falange distal: 2) do espaço entre a primeira e a quinta falange distal (TS toe spready) e 3) o espaço entre a borda proximal do pé e a terceira falange distal (PL print length). A seguir, era calculado o índice SFI (sciatic function index), con-forme a fórmula proposta e abaixo descrita.

A partir dos valores encontrados nos testes de walking track foi realizado o cálculo do SFI, conforme a fórmula abaixo:

As medidas são identificadas pela letra E, referentes à pata em estudo, e pela letra N, referentes à pata normal.

Na interpretação dos resultados, os valores de SFI = 0 são considerados normais, ausência de lesão; os valores próximos a -100 indicam lesão total do nervo.

Avaliação histológica
Após 16 semanas do procedimento cirúrgico, os ratos fo-ram sacrificados por inalação letal com éter sulfúrico e os nervos ciáticos foram ressecados. As amostras foram fixadas em formalina e incluídas em parafina, cortados por micrótomo e posteriormente submetidas a método de coloração com hematoxilina e eosina. Foram adotados os critérios de avaliação descritos no quadro 1, tendo como padrão de normalidade a leitura microscópica de corte histológico preparado com o nervo ciático contralateral de cada rato (fig. 5).

Avaliação estatística

Os resultados obtidos em todos os grupos de estudo foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer, sen-do adotado p < 0,05 como nível de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

Avaliação funcional

Os resultados da avaliação funcional de todos os ratos antes dos procedimentos cirúrgicos demonstraram valor de SFI = 0, compatível com função normal do nervo ciático.

Foram excluídos da avaliação funcional os ratos que evoluíram com deformidades que impediam apreciação correta do resultado obtido, conforme demonstrado na tabela 1.

Na 16a semana de evolução após o reparo do nervo ciático, foram avaliados sete ratos do grupo sutura, sete do grupo cola de fibrina e nove do grupo sutura e cola de fibrina.

As avaliações funcionais estão demonstradas no gráfico 1.

Conforme o gráfico 1, observam-se as modificações no SFI, logo após a indução da transecção nervosa. O SFI diminuiu para -100, indicando ausência de função. Após quatro semanas a média do grupo S foi de -37 (37 a -111); no grupo C a média foi de -20 (-14 a -26); e no grupo SC a média foi de -20 (-8 a -32), com p > 0,05 entre as três médias. Na 12a semana a média foi de -45 (11 a -102) no grupo S, de -44 (-29 a -59) no grupo C e de -17 (-12 a -22) no grupo SC, com resultado significativamente melhor no grupo SC, em comparação com o grupo S (p < 0,05) e em comparação com o grupo C (p < 0,05). Os valores de SFI na 16a semana indicaram pioras nos três grupos, devido à ocorrência de contraturas nas patas, porém não de intensidade suficiente para a exclusão destes ratos.

Avaliação histológica
Os resultados da avaliação histológica na 16a semana de evolução dos ratos submetidos à sutura (grupo S) demonstram proliferação de tecido conjuntivo fibroso jovem e infiltração de histiócitos e linfócitos, com presença de células gigantes tipo corpo estranho englobando corte transversal de material cilíndrico regular e homogêneo tangencial de material irregular (fig. 6).

Os resultados dos ratos submetidos ao reparo do nervo ciático com cola de fibrina (grupo C) demonstram tecido conjuntivo fibroso jovem e discreta infiltração de linfócitos e mastócitos (fig. 7).

Os resultados dos ratos submetidos ao reparo do nervo ciático com sutura associada à cola de fibrina (grupo SC) demonstraram tecido conjuntivo fibroso jovem infiltrado por histiócitos linfócitos, mastócitos, células gigantes tipo corpo estranho englobando corte transversal de material filamentar cilíndrico regular e homogêneo, bem como material irregular (fig. 8).

Na avaliação histológica observou-se proliferação moderada de tecido conjuntivo no grupo S e leve nos grupos Sc e C. A ocorrência de leve edema foi observada nos grupos SC e S e ausente no grupo C. Quanto à infiltração inflamatória, no grupo SC foi moderada, enquanto que nos grupos C e S foram leves.

DISCUSSÃO

Nas lesões nervosas podem ser empregadas diferentes técnicas para a reparação de nervos periféricos, utilizando as suturas epineurais e perineurais(6). Outra técnica utiliza cola de fibrina, autóloga ou não, a qual tem sido ainda objeto de espe-culação(6). A cola de fibrina tem sido usada em diversas especialidades cirúrgicas desde 1980 e o efeito da cola de fibrina na cicatrização de feridas foi primariamente bem documentado nos estudos de Bertelli e Mira(7). O exato efeito da cola de fibrina no reparo da lesão do tecido nervoso e os resultados funcionais subseqüentes requerem investigação.

No presente estudo procedeu-se à comparação entre três formas de reparação de lesões do nervo ciático de ratos: a sutura epineural com fio mononáilon 10.0, o uso isolado da cola de fibrina e a associação entre ambas.

Poucos estudos foram encontrados na literatura que avaliassem simultaneamente as três formas de reparo de nervo ciático em ratos, por meio de avaliações funcionais e histológicas. Varejão et al(8) mostraram que o walking track é um método útil, não invasivo e simples de avaliação funcional na recuperação do nervo ciático em ratos após transecção nervosa. Dellon e Mackinnon(9), avaliando resultados de reparação nervosa do ciático em ratos, observaram que, a partir de quatro meses da transecção nervosa e reparo com sutura, todos os membros posteriores operados tiveram retração, evoluindo para garra, a qual impossibilitava a análise das pegadas deixadas pelos ratos, sugerindo que os estudos que utilizassem o walking track deveriam ser realizados no máximo três meses após a transecção nervosa. O presente estudo realizou a última mensuração do walking track com 16 semanas e mesmo assim ocorreu a formação de garras, demonstrada pela piora quantitativa do SFI.

Maeda et al(10) compararam a sutura epineural com baixa e com alta tensão, associadas a interposição de enxerto nervoso no foco da transecção em nervo ciático de ratos obtendo resultados funcionais do walking track superiores com o uso da sutura epineural. Menovski e Beek(11) não encontraram diferenças significativas após o reparo de nervo ciático em ratos comparando cola de fibrina isolada e sutura epineural reforçada com laser de CO2. Tetick et al(4) compararam a neurorrafia perineural e a epineural associadas ou não ao uso da cola de fibrina em ratos submetidos previamente à transecção do nervo ciático. Esses autores avaliaram os animais após 12 semanas de evolução, utilizando análise funcional pelo teste walking track histomorfométrica, pela mensuração da circunferência e pesagem do músculo gastrocnêmio. Demonstraram melhores resultados funcionais com a técnica de sutura epineural em relação ao uso da cola de fibrina.

O principal foco nas investigações atuais em reparos de nervos lesionados tem sido o desenvolvimento de procedimentos que evitem ou minimizem o emprego de suturas e reduzam o crescimento fibroso no local do reparo. Nesse contexto, De Vries et al(12) observaram que o uso da cola de fibrina em neurocirurgia não induz a fibroplasia, o edema e a infiltração inflamatória, porém reduz significantemente o tempo cirúrgico. Essa evidência foi corroborada no presente estudo, pois o tempo cirúrgico no grupo de ratos submetidos ao reparo nervoso por cola de fibrina foi também menor que o dos demais. Histologicamente, nos grupos S e SC foi observada a formação de resposta inflamatória de corpo estranho ao fio de sutura, sendo estes achados já relatados em estudos prévios(5).

Mehta et al(13) propuseram que reação inflamatória e proliferação de tecido conjuntivo no reparo de lesões nervosas representam obstáculo focal para a reparação de mielina e axônio, comprometendo a transmissão do impulso nervoso. Essas conclusões foram obtidas em estudo experimental em ratos, em que foi comparado o reparo por sutura do nervo ciático com o reparo por cola de fibrina. Reação inflamatória com formação de granuloma de sutura foi observada nos grupos em que foi usada sutura.

No presente estudo, os resultados da avaliação funcional na quarta semana de evolução não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre as três técnicas de reparo. Na 12a semana houve vantagens no emprego da associação da sutura com a cola de fibrina sobre as demais técnicas.

CONCLUSÃO

A sutura epineural associada à cola de fibrina no reparo da transecção aguda do nervo ciático de ratos mostrou melhores resultados que o emprego de sutura ou da cola de fibrina aplicadas isoladamente.

1. Pardini Jr. A.G.: Traumatismos da Mão, 3a ed. Rio de Janeiro: Medsi, p. 381-400, 2000.
2. Kimura L.K., Rodrigues C.J., Rodrigues Jr. A.J., et al: Mapeamento fascicular de nervos periféricos por método histoquímico da acetilcolinesterase. Rev Bras Ortop 31: 203-210, 1996.3. Widthölter H., Eckert S., Stevens A.: Measurement of atactic and paretic gait neuropathies of rats based on analysis of walking tracks. J Neurosci Methods 32: 199-205, 1990.
4. Tetick C., Ozer K., Ayan S., et al: Conventional versus epineural sleeve neurorrhaphy technique: functional and histomorphometric analysis. Ann Plast Surg 49: 397-403, 2002.
5. Bacelar J.C.S.: Avaliação da ação das drogas hidrato de cloral, cetamina/xilasina e tiopental sódico na anestesia em ratos [Dissertação de Mestrado em Princípios da Cirurgia]. Curitiba: Brasil, Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná, p. 49, 1999.
6. Cruz N.I., Debs N., Fiol R.E.: Evaluation of fibrin glue in rat sciatic nerve repairs. Plast Reconstr Surg 78: 369-373, 1986.
7. Bertelli J., Mira J.: Nerve repair using freezing and fibrin glue: immediate histologic improvement of axonal coaptation. Microsurgery 14: 135-140, 1993. 8. Varejão A.S.P., Meek M.F., Ferreira J.A., et al: Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J Neurosci Methods 108: 1-9, 2001.
9. Dellon A.L., Mackinnon S.E.: Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery 10: 220225, 1989.
10. Maeda T., Hori S., Sasaki S., Mauro S.: Effects of tension at the site of coaptation on recovery of sciatic nerve function after neurorrhaphy: evaluation by walking track measurement, electrophysiology, histomorphometry, and electron probe X-ray microanalysis. Microsurgery 19: 200-207, 1999.
11. Menovsky T., Beek J.F.: Laser, fibrine glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve. J Neurosurg 95: 694-699, 2001.
12. De Vries J., Menovsky T., Van Gulik S., et al: Histological effects of fibrin glue on nervous tissue a safety study in rats. Surg Neurol 57: 415-422, 2002.
13. Mehta V.S., Suri A., Sarkar C.: Microneural anastomosis with fibrin glue: an experimental study. Neurol India 50: 23-26, 2002.