Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo.
1. Fisioterapeuta; Mestre em Ortopedia, Traumatologia e Reabilitação - FMRPUSP.
2. Engenheiro Especialista em Laboratório - FMRP-USP.
3. Professor Titular de Ortopedia na FMRP-USP.
Endereço para correspondência (Correspondence to): Helena Brigliadori Pugliesi, Rua Marechal Caxias, 2.885 - 14101-011 - Franca, SP, Brasil. Tel.: +55 16 3722-
1553. E-mail: hbpugliesi@netsite.com.br
O joelho é um dos locais mais vulneráveis do corpo humano em atletas, especialmente em esportes de alta velocidade e de impacto forte, ou seja, com risco maior de lesão por trauma ou desgaste articular. A estabilidade articular depende de três fatores: a) dos ajustes ósseos com a articulação; b) dos ligamentos que mantêm os ossos unidos; e c) dos músculos que movem e estabilizam a articulação em diversas posições. Embora seja de esperar que os ligamentos de animais condicionados ao exercício tenham comportamento mecanicamente superior, há pouca concordância em relação aos efeitos do exercício no ligamento, sendo estes fontes de inúmeras pesquisas(1).
Os ligamentos apresentam um tipo de tecido conectivo que combina a função de suporte e grande resistência. Alguns estudos anteriores classificavam esse tipo de tecido como metabolicamente inativo. Estudos mais recentes têm demonstrado claramente que eles são metabolicamente ativos. A resistência dos ligamentos no ponto de inserção no osso é diminuída pela imobilização e aumentada com o treinamento(2).
A variação metabólica e o estado funcional afetam a resistência ligamentar, porém, apenas a testosterona, a tiroxina e o exercício físico aumentam a resistência do ligamento(3).
Os ligamentos são compostos por tecidos dinâmicos, que sofrem hipertrofia com o exercício e atrofia com a imobilização prolongada(4).
Estudos feitos com o ligamento cruzado anterior (LCA) de ratos apontam que não há diferença significativa nas propriedades mecânicas dos ligamentos dos animais que realizaram atividade física quando comparados com o grupo controle, que não era submetido a nenhum tipo de exercício(5). Isso também foi demonstrado posteriormente em estudos com o ligamento colateral medial e o ligamento cruzado anterior, respectivamente(3,6).
Em contraposição, há relatos de que ratos que praticam atividade física apresentam maior resistência ligamentar(7), sen-do isso confirmado em um estudo em coelhos em que se testou o ligamento cruzado anterior, observando alteração apenas nos valores de energia necessária para romper o ligamento, mas não nos valores de rigidez e força máxima(8).
O joelho foi escolhido por ser ele alvo de grande parte das lesões esportivas, uma vez que tanto a prevenção quanto a reabilitação de eventuais lesões seriam temas altamente relevantes.
Esta pesquisa tem como objetivo analisar os efeitos mecânicos da atividade física, na forma de natação, no ligamento cruzado anterior de ratos, visto que esse assunto ainda é bastante controverso, de acordo com relatos encontrados na bibliografia.
MATERIAL E MÉTODOS
O grupo experimental foi constituído por 96 ratos da linhagem Wistar, machos, adultos e pesando, em média, 204g, o que caracteriza que os animais tinham praticamente a mesma idade. O número de animais foi estipulado para obtermos um n significativo, ou seja, ter maior número de espécimes para a realização dos ensaios mecânicos e, assim, menor probabilidade de erro durante a análise estatística.
Os animais foram divididos em quatro grupos, com 24 em cada, sendo dois grupos controles e dois que praticaram natação (tabela 1). Os animais do grupo controle ficaram confinados em gaiolas durante todo o período da pesquisa. Todos os grupos se alimentaram recebendo a mesma ração especial para ratos e água ad libitum e eram mantidos em gaiolas com no máximo cinco animais.
A atividade física realizada foi a natação. Essa atividade era praticada em uma caixa de plástico com 1m de profundidade, 1m de largura e 1,5m de comprimento (figura 1). A água era mantida à temperatura entre 33 e 35oC por um aquecedor e monitorada por um termostato.
Os animais nadavam durante uma hora diária, sendo observados para que não descansassem e nem parassem de nadar. A natação era praticada cinco vezes por semana. Esse treinamento foi mantido para os grupos G8N e G4N, sendo a única diferença o período de natação: o primeiro nadou por oito semanas e o segundo por quatro semanas.
Após o período experimental, os animais foram submetidos a eutanásia com inalação excessiva de éter sulfúrico e tiveram seus membros posteriores bilaterais desarticulados no quadril. Os membros foram dissecados, permanecendo apenas o ligamento cruzado anterior, o fêmur e a tíbia. Foram removidos a pata do animal, a fíbula, a musculatura, a cápsula articular, os meniscos e os demais ligamentos. Assim, obteve-se o espécime fêmur-ligamento cruzado anterior-tíbia praticamente pronto para a realização dos testes de tração (figura 2).
Os espécimes assim obtidos foram envolvidos em gazes embebidas em soro fisiológico e congelados a -20oC até a realização dos ensaios mecânicos de tração.
Para a realização do ensaio mecânico de tração foram confeccionadas garras (figuras 3 e 4) para a fixação do fêmur e da tíbia, permitindo dessa forma o acoplamento à máquina universal de ensaio (MUV).
Para a realização dos testes de tração os espécimes eram retirados do congelador por quatro horas e mantidos em temperatura ambiente, até o seu descongelamento completo.
Devido à pequena dimensão do ligamento cruzado anterior e conseqüente dificuldade de seu encaixe nas garras femoral e tibial, foi realizada a retirada de uma pequena parte posterior dos côndilos femorais com auxílio de um alicate de cutícula.
Durante o ensaio mecânico de tração, a articulação do joelho foi mantida a 90o de flexão.
Os ensaios foram realizados na máquina de ensaios mecânicos do Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, com velocidade de 0,5mm/min. A força foi mensurada com uma célula de carga de 50kg da marca Kratos e as deformações foram registradas por um relógio comparador Mitutoyo com resolução de um centésimo de milímetro, sendo a pré-carga de 0,2kg, para acomodação do sistema(9), e as leituras realizadas a cada 10 centésimos de milímetro.
Com os valores obtidos das forças e deformações foram construídos gráficos. O gráfico 1 mostra o padrão dos gráficos obtidos.
As forças máximas foram os maiores valores obtidos de cada ensaio, antes que ocorresse a ruptura do ligamento.
A rigidez foi calculada pelo valor da tangente do ângulo formado pela fase linear do gráfico com o eixo x.
Para a análise estatística dos valores obtidos nos ensaios mecânicos de tração foi utilizado o teste t de Student, com intervalo de confiança de 95%.
Para a execução dos testes t de Student e do teste F utilizouse o software estatístico MinitabTM.
Para a verificação da igualdade entre os grupos foram realizados testes de hipóteses, através dos quais se expressa determinado parâmetro da população e procura-se evidência para rejeitar ou não a hipótese nula (a da não diferença entre duas variáveis). Para tanto, foram utilizadas as seguintes hipóteses: H0 - não existe diferença significativa entre os grupos analisados; H1 - existe diferença significativa entre os grupos analisados.
Para testar as hipóteses foi utilizado o teste t de Student, no qual foi analisado o valor de P obtido entre os grupos comparados. Para diferença estatisticamente significativa é necessário P < 0,05.
As análises estatísticas foram feitas a fim de observar a existência de diferença significativa nos valores de força máxima e rigidez entre G8N e G8C, G4N e G4C, G8N e G4N, e G8C e G4C.
RESULTADOS
Dos 192 espécimes totais, 14 foram inutilizados devido à morte do animal no decorrer do trabalho e 19 foram desprezados por motivos técnicos, restando no total 159 espécimes, entre ligamentos direito e esquerdo.
A média de peso inicial dos animais do G8N era de 199,7g ± 6,8 e após oito semanas de natação a média era de 440,5g ± 34,2. No G8C, a média inicial era de 200,4g ± 7,1 e a final, de 431,5g ± 49,6. No G4N, a média de peso inicial era de 207,3g ± 5,7 e após quatro semanas de natação, de 365,2g ± 35,5. No G4C, a média inicial era de 208,6g ± 5,4 e a final, de 354,0g ± 40,5.
No gráfico 2 tem-se o diagrama de colunas com os valores da média e desvio-padrão para força máxima dos grupos G8N, G8C, G4N e G4C.
Foi realizada análise estatística para comparação entre G8N e G8C e observou-se P = 0,336, não havendo, portanto, diferença estatisticamente significativa entre esses dois grupos. Entre o G4N e G4C, o valor de P = 0,009 mostrou diferença significativa entre os grupos, para valores de força máxima.
Em adição a essas comparações, analisamos os grupos G8N e G4N e os grupos G8C e G4C. Observamos para os grupos G8N e G4N valor de P = 0,020, havendo assim diferença significativa entre eles, sendo o melhor resultado encontrado no G4N. Já entre os grupos G8C e G4C, o valor foi de P = 0,197, não apresentando diferença significativa.
No gráfico 3 têm-se os valores de média e desvio-padrão para rigidez dos grupos G8N, G8C, G4N e G4C.
Mais uma vez, aplicou-se o teste t de Student e encontrouse P = 0,014, mostrando diferença estatisticamente significativa entre os grupos G8N e G8C para os valores de rigidez. Entre os grupos G4N e G4C o valor de P = 0,097 mostrou que não houve diferença significativa entre eles.
Complementando a análise estatística compararam-se os grupos G8N e G4N e G8C e G4C. Observamos entre os grupos G8N e G4N valor de P = 0,621 e, entre os grupos G8C e G4C, P = 0,322, mostrando que não houve diferença significativa entre eles para os valores de rigidez.
DISCUSSÃO
A revisão bibliográfica realizada mostrou-se bastante escassa e controversa, com poucos estudos sobre o ligamento cruzado anterior. Devido à grande incidência de lesões que acometem esse ligamento e por suas implicações clínicas, ele foi escolhido para este trabalho. O ligamento mais utilizado pela literatura para verificar os efeitos da atividade física foi o ligamento colateral medial, pelo seu fácil acesso.
Para a realização dos ensaios mecânicos de tração foram confeccionadas garras para a fixação do fêmur e da tíbia. Nas primeiras tentativas estava ocorrendo ruptura na epífise femoral distal, portanto, foi confeccionado um dispositivo para realizar uma contraforça na porção distal do fêmur. Resolvido esse problema, começamos a trabalhar na melhora da garra tibial, pois a primeira confeccionada estava lesando o ligamento antes da realização do teste.
Então, foi construída outra garra para que isso não mais ocorresse, mas nesta garra a parte superior da tíbia estava escorregando. Esse problema foi facilmente solucionado com a colocação de um pino apoiando a estrutura. Resolvidos esses problemas, começamos a ter dificuldade em encaixar os espécimes nas garras, devido ao seu pequeno tamanho. Para solucioná-la foi retirada pequena parte dos côndilos femorais com auxílio de um alicate de cutícula. Esse procedimento não interfere nos resultados do teste, pois a inserção do ligamento cruzado anterior é posterior e externa.
Estudos relataram que, quando o ligamento cruzado anterior é testado em sua posição anatômica, ele apresenta maiores valores de força máxima do que quando é testado na direção do eixo tibial. Neste trabalho procuramos sempre realizar os testes seguindo a orientação do ligamento(10).
Em outro estudo foi demonstrado que não há diferença nos resultados dos testes realizados com espécime em 0o, 45o ou 90o de flexão. Pode-se supor, então, que o teste apenas na posição de 90o é suficiente, sendo isso usado nesta pesquisa(11).
Em todos os animais testados a ruptura ligamentar ocorreu no nível da inserção tibial, através de avulsão ligamentar, o que coincide com a literatura consultada(10), que comenta que, em laboratório, dificilmente a ruptura irá ocorrer na substância ligamentar, mas, sim, no ponto de inserção ligamentar, por ser este o ponto de maior fraqueza.
Pesquisas(12) demonstram que a velocidade de tração imposta pela máquina de ensaio pode variar de 0,01 a 5mm/seg sem que este fator comprometa os resultados. Isso também foi observado em estudos realizados em velocidade lenta (0,003mm/seg), média (0,3mm/seg) ou rápida (113mm/seg), que mostraram resultados semelhantes nas propriedades do ligamento cruzado anterior(13). Neste trabalho foi usada velocidade lenta de 0,008mm/seg (0,5mm/min), o que não interfere nos resultados.
Tipton et al(12) e Woo et al(13), em estudos do complexo fê-mur-ligamento cruzado anterior-tíbia, mostram que os valores de suas propriedades estruturais em indivíduos jovens são significativamente maiores do que em idosos. Os valores da rigidez e da força máxima em espécimes jovens são até três vezes maiores do que em espécimes idosos. Esse achado está em concordância com a presente pesquisa, que apresentou maiores valores de força máxima e rigidez para os grupos de quatro semanas, tanto de natação quanto de controle, que são animais mais jovens, quando comparados com seus respectivos grupos de oito semanas.
Estudos relatam(12,14) que a resistência do ligamento cruzado anterior está diretamente relacionada com o peso corporal do animal. Porém, neste trabalho, não houve grande variação de peso dos animais, não sendo, portanto, observada nenhuma relação entre esses dois parâmetros.
Em uma pesquisa, 60 ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: um que corria duas vezes ao dia durante 15 minutos por quatro semanas, um que realizava alongamento, um que era imobilizado e o último que era o controle. Após quatro semanas foi retirado o ligamento cruzado anterior e observou-se que não houve nenhuma diferença significativa entre os grupos(5). Nesta pesquisa os resultados estão de acordo com esse relato.
Foi realizada uma pesquisa utilizando 120 ratos fêmeas, que foram divididos em quatro grupos: um engaiolado, outro de controle, o terceiro colocado em um tambor com superfície lisa para caminhar e o quarto grupo em um tambor de superfície desigual, durante 15 minutos diários, cinco vezes por semana.
Após cinco semanas sacrificaram-se os animais e testaram-se os ligamentos colaterais, concluindo-se que existe relação direta entre resistência ligamentar e grau de mobilização da articulação do joelho, pois os grupos que se exercitaram apresentaram aumento significativo na resistência do ligamento, sendo esse ainda maior no grupo que caminhava em tambor com superfície desigual(1). Na presente pesquisa foi estudado o ligamento cruzado anterior e neste não foi observada diferença significativa entre os grupos de animais.
Tipton et al(7) fizeram um estudo com ratos machos, com grupos que realizavam atividade em um cilindro giratório durante seis semanas apenas e outro que fez treinamento de 12 semanas de atividade e quatro de repouso. Observaram que o grupo de um único período de treinamento não apresentou aumento na resistência ligamentar, porém, o de vários períodos mostrou aumento significativo. Isso também foi concluído nesta pesquisa, na qual se realizou apenas um período de treinamento e observou-se que não houve diferença significativa entre os grupos de animais.
Viidik(8) fez um estudo com 36 coelhos machos: um grupo realizava corridas três vezes por dia, durante 40 semanas, e o outro era o de controle. Após o período de treinamento foi retirado o ligamento cruzado anterior e obtiveram-se os seguintes resultados: a energia necessária para romper o ligamento foi significativamente maior no grupo de treinamento; a rigidez apresentou leve aumento, mas não significativo, e não houve diferenças para os valores de força e deformação máximas, estando mais uma vez de acordo com este trabalho.
Um estudo realizado com 93 ratos Wistar analisou o ligamento colateral medial. Os animais foram divididos em grupos: um realizava natação e atividade espontânea; outro, apenas natação; outro, apenas atividade espontânea; e o último ficava restrito em gaiolas. Entre os grupos de natação, um nadou 16 semanas e o outro, oito semanas e ficou sem atividade por mais oito semanas antes do sacrifício. Após a realização dos testes observou-se que houve aumento significativo na resistência do ligamento dos grupos que realizaram natação, mesmo do que nadou e depois ficou sem atividade(6).
Esse achado contradiz os resultados desta pesquisa com o ligamento cruzado anterior.
Outro estudo foi realizado com 75 ratos machos para observar o ligamento cruzado anterior. Os animais foram divididos em cinco grupos, sendo um controle, um que corria três vezes por semana durante 30 minutos e outro, durante 60 minutos; o quarto e o quinto grupo corriam seis vezes por semana durante 30 e 60 minutos, respectivamente. Observou-se que a freqüência do treinamento influi nos resultados e que o melhor tipo de treinamento foi o do grupo que corria seis vezes por semanas durante 30 minutos diários. Concluiu-se que os exercícios de resistência promovem efeito positivo no ligamento cruzado anterior (aumento da resistência e da rigidez) e que o melhor treinamento é o de baixa duração e alta freqüência(6). Esse resultado não coincide com o encontrado neste estudo.
Na pesquisa realizada encontramos resultados variados para os valores de força máxima e rigidez do ligamento cruzado anterior dos animais que praticaram a natação. Os valores de força máxima apresentaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos G4N e G4C, e G8N e G4N; o G4N apresentou valores significativamente maiores, o que acreditamos ser devido à idade do animal. Em relação à rigidez, observamos aumento estatisticamente significativo entre os grupos G8N e G8C.
CONCLUSÃO
A partir dos experimentos realizados, conclui-se que a natação praticada nos períodos de oito e quatro semanas não influencia de forma significativa no aumento da resistência do ligamento cruzado anterior, apesar de haver tendência ao aumento.
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