Trabalho realizado no Laboratório de Lesões Medulares e Trauma Experimental do Serviço de Ortopedia e Traumatologia (SOT), Hospital Universitário Cajuru (HUC), Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR).
1. Médico Ortopedista do Serviço de Ortopedia e Traumatologia (SOT) do Hospital Universitário Cajuru (HUC) da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR).
2. Doutor; Chefe do SOT, HUC, PUC-PR.
3. Médico Residente do SOT, HUC, PUC-PR.
4. Médico Ortopedista Fellow do Grupo de Coluna do SOT, HUC, PUC-PR.
Endereço para correspondência (Correspondence to): Rua Monsenhor Manoel Vicente, 845, ap. 71, Água Verde - 80620-230 - Curitiba, PR. Tel.: (41) 3243-2661. E-mail: evialle@viallespine.com.br
A pele é o maior órgão do corpo afetado pelo trauma raquimedular (TRM). Complicações de pele representam uma das principais causas de ansiedade, morbidade e interferência com os objetivos de reabilitação do paciente. Devido às úlceras de pressão serem a complicação de pele mais séria e freqüente decorrente do TRM, pouca atenção tem sido dada a outras complicações de pele que podem igualmente afetar a vida do lesado medular e até mesmo predispor à formação das úlceras(1-4). Também existem controvérsias quanto aos efeitos de denervação sobre a cicatrização de pele(5-9).
Os estudos que envolvem lesão medular experimental são fundamentais para a compreensão dos mecanismos secundários de lesão tecidual decorrentes do trauma raquimedular. Existe a necessidade de entender como órgãos e sistemas que aparentemente não estão relacionados com a lesão medular são comprometidos e a que nível essas alterações chegam. Dados coletados através de estudos experimentais mostram que os distúrbios ocorridos em cobaias podem ser extrapolados ao ser humano, respeitando-se as devidas proporções anatômicas, fisiológicas e metabólicas.
Diversos estudos experimentais foram desenvolvidos na tentativa de padronizar o método de avaliação e da quantificação da lesão medular experimental em vários modelos(1-9). Esses estudos limitam-se a analisar as alterações motoras e sensitivas, sem abordar o animal como um todo e, por vezes, não mencionando a ocorrência de alterações sistêmicas após lesão medular.
A histopatologia da pele denervada não foi estudada extensivamente, e na maioria dos textos não há referência ao as-sunto(10). Estudos clínicos com pacientes vítimas de TRM revelam espessamento da pele e biópsias demonstraram imagem compatível com fibrose da derme associada a esclerose progressiva. Imunofluorescência indireta utilizando anticorpos anticolágeno demonstrou redução do colágeno tipo III na epiderme e predomínio do colágeno tipo I em toda a derme, incluindo tecido adiposo(11,12).
Revisando a literatura experimental, encontram-se estudos envolvendo cicatrização de feridas em áreas denervadas, mas não há relato de estudo das alterações da pele em modelos experimentais de lesão medular. Esses animais, em estudos de longa duração, apresentam os mesmos tipos de complicações observadas em humanos, podendo servir como modelo para o estudo de alterações de pele no TRM, assim como seu manejo.
Os objetivos da pesquisa foram: avaliar as alterações anatomopatológicas cutâneas distais de ratos submetidos à lesão medular experimental, em tempos variados de evolução, após lesão medular contusa padronizada, comparando as alterações agudas com as crônicas; avaliar a influência da intensidade do trauma medular sobre as alterações cutâneas do animal.
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Hospital Universitário Cajuru, vinculado à Direção de Ensino e Pesquisa - PUC-PR, seguindo as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. Foram utilizados 44 ratos Wistar machos, pesando entre 300 e 350g, criados no Biotério Central da PUC-PR. Todos receberam água e ração (Nuvilab CR-1 - Nuvital, Colombo-PR) ad libitum, com controle de luz (ciclos claro-escuro de 12 horas) e temperatura ambiente (25ºC ± 1).
Todos os procedimentos experimentais seguiram as normas do MASCIS (Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study)(13). Os animais foram anestesiados com pentobarbital na dose de 65mg/kg intraperitoneal (ip), cinco minutos previamente aos experimentos e submetidos a tricotomia da região dorsal seguida de anti-sepsia com solução de PVPI degermante. Realizou-se, então, incisão longitudinal sobre a linha média dorsal em cerca de 5cm de pele e tecido celular subcutâneo com lâmina de bisturi no 15, seguida de afastamento subperiostal da musculatura paravertebral. Após essa exposição, foi realizada laminectomia (T9T10) sem lesar o saco dural (figura 1), com o uso de um sacabocado.
O animal foi então preso por clamps ao Impactor NYU, acoplado a um PC com software específico (figura 2). Com esse aparelho, dados como a velocidade de queda da haste, o momento do impacto e, principalmente, a compressão sofrida pela medula são monitorados e expressos na forma de um gráfico, que determina se a lesão ocorreu dentro dos parâmetros predeterminados pelo protocolo MASCIS, para que o animal possa ser incluído no estudo(13).
Os animais foram submetidos a uma lesão contusa provocada pela queda de uma haste com 10g numa área seccional de 2mm2 de uma altura de 25mm (n = 28). Desses, um grupo agudo (n = 20) foi sacrificado em quatro dias e um grupo crônico (n = 8), em 21 dias. Outro grupo crônico de oito animais foi submetido a trauma com lesão de 12,5mm de altura, com a finalidade de avaliar a influência da energia do trauma sobre as alterações cutâneas. Um grupo controle (n = 4) foi submetido a laminectomia sem lesão medular e sacrificado em quatro dias para estudo histológico.
Após a lesão, os animais foram retirados do aparelho Impactor NYU, submetidos à sutura da pele com fio mononáilon 5.0 (Ethicon) e acondicionados em gaiolas sob temperatura constante (24o Celsius). Passaram então a ser manejados com expressão vesical de 8/8 horas pelo método de Crède e receberam antibioticoterapia com cefazolina 1mg ip/dia por dois dias.
A lesão medular completa foi confirmada, em todos os animais, com avaliação da função motora através da escala descrita por Basso et al(14), modificada por Vialle et al(15,16).
Os animais foram sacrificados em tempos variados, con-forme os grupos acima citados, com overdose de tiopental (100mg/kg, ip) seguida de infusão intracardíaca com solução salina fisiológica até a completa exsangüinação e, após, com 300ml de solução formalina a 10% tamponada (pH 6,8, com 4,5g/L de fosfato monobásico de sódio e 6,5g/L de fosfato dibásico de sódio - fabricação própria). Após a fixação, os animais, devidamente identificados, foram armazenados em frascos individuais contendo a mesma solução tamponada, permanecendo submersos até o estudo anatomopatológico.
Os animais foram, então, submetidos a uma necropsia, com retirada de 1cm2 de pele da face lateral do 1/3 médio da coxa esquerda após avaliação de possíveis alterações macroscópicas.
As peças foram, então, submetidas a um processo previa-mente padronizado de preparo histológico, sendo incluídas em blocos de parafina. Lâminas para análise histológica fo-ram confeccionadas a partir desses blocos e coradas pelo método da hematoxilina-eosina (HE). A avaliação das alterações histológicas foi feita através de microscopia óptica por um patologista, que recebeu as lâminas sem nenhuma identificação quanto à intensidade da lesão ou ao tempo de evolução em que o animal foi sacrificado.
Realizaram-se, então, cinco medidas em cada imagem ge-rada pelo software OPTIMAS 6.0® acoplado a um microscópio OLYMPUS BX 50® e a uma câmera SONY ®, perfazendo um total de 20 medidas em cada lâmina. O aumento da objetiva do microscópio era de quatro vezes e o da ocular, de 10 vezes.
A medida da pele foi feita desde a camada granulosa da epiderme até a transição entre a hipoderme e o tecido muscular estriado esquelético.
Os resultados foram agrupados em uma tabela e submetidos a estudo estatístico pelo método do t de Student, utilizando o valor de p = 0,05 para definir diferença significativa entre os grupos avaliados.
RESULTADOS
Cinco animais foram a óbito nas primeiras 24 horas após a lesão, mortalidade aproximada à citada na literatura(14,17,18), e não foram incluídos no estudo. Nenhum dos animais apresentou recuperação motora durante o período do estudo.
No estudo morfométrico de pele dos animais houve uma atrofia importante nos grupos mantidos por três semanas (grupos crônicos I e II) e o grupo agudo teve uma leve atrofia da pele. No gráfico 1 observamos as médias morfométricas (em micrômetros) da pele com seus respectivos desvios-padrões.
Não foram encontradas alterações morfométricas importantes entre o grupo controle (571,95 ± 73,35µm) e o grupo agudo (551,79 ± 84,17µm) (p = 0,81), como também não foi observada diferença significativa entre os grupos crônico I (314,55 ± 50,98µm) e crônico II (304,89 ± 36,3µm) (p = 0,83).
A atrofia encontrada na derme e epiderme na comparação entre o grupo agudo e os grupos crônicos I e II é evidente (p = 0,0006 e p = 0,001, respectivamente). Também foi observada grande diferença entre o grupo controle e os grupos crônicos I e II (p = 0,0008 e p = 0,0003, respectivamente).
DISCUSSÃO
O aparelho Impactor é capaz de produzir de forma padronizada lesões com a queda da haste de alturas de 12,5, 25 e 50mm. Optou-se por realizar lesões de 25mm e 12,5mm devido à alta mortalidade em ratos lesados com 50mm em outros estudos realizados em nosso laboratório. Neste estudo a energia utilizada para a produção do trauma (12,5mm x 25mm) não interferiu no grau da atrofia da pele. Entretanto, a variável mais importante é o tempo posterior ao trauma.
Optou-se por manter um período de três semanas para o estudo crônico, pois o protocolo para este tipo de estudos em animais lesados medulares preconiza o sacrifício nesse período de tempo, permitindo, assim, estudos em conjunto entre diversos laboratórios(13).
Não existem dados similares para comparação, tanto experimentais quanto clínicos. Sabe-se que em biópsias de pacientes com TRM crônico há espessamento de pele, alteração da composição do colágeno e até amiloidose(11,12). Entretanto, esses estudos foram realizados em pacientes com complicações crônicas de pele e não há como determinar se os achados são parte da evolução natural da pele denervada ou um fenômeno de reação às lesões prévias.
A hipótese que pode ser levantada e futuramente estudada é a de que a atrofia de pele encontrada após o TRM predisporia a complicações como escaras e infecções superficiais, e que terapias para contenção dessa atrofia, como estimulação elétrica e suporte nutricional, evitariam tais complicações.
A avaliação da atrofia da pele serve como parâmetro para outros estudos envolvendo não só terapias para lesão medular, mas métodos de reabilitação dos membros inferiores em tecidos desprovidos de inervação.
CONCLUSÕES
1) Foram encontradas alterações na pele dos membros posteriores dos animais lesados medulares na terceira semana após
o trauma. A diferença entre grupos agudo e crônico foi estatisticamente significativa.
2) Não houve relação entre alterações cutâneas e a intensidade do trauma.
1. Garrett A.B., MacDonald R.E.: Dermatologic problems in the spinal cord injury patient. Phys Med Rehabil 1: 489-487, 1987.
2. Parsons K.C., Stawiski M.A.: Dermatological complications of spinal cord injury. Abstract Digest of the American Spinal Injury Association. Chicago, 1984.
3. Reed W.B., Pidgeon J., Becker S.W.: Patients with spinal cord injury, clinical cutaneous studies. Arch Dermatol 83: 379-385, 1961.
4. Wilson C.L., Walshe M.: Incidence of seborrheic dermatitis in spinal cord injury patients [abstract]. Br J Dermatol 119 (33 Suppl): 48, 1988.
5. Basson M.D., Burney R.E.: Defective wound healing in patients with paraplegia and quadriplegia. Surg Gynecol Obstet 155: 9-12, 1982.
6. Diegelmann R.F., Lindblad W.J., Hussey R.W., et al: Analysis of fibrogenic process in denervated tissues of spinal cord injury patients. Plast Reconstr Surg 83: 309-314, 1989.
7. Localio A.S., Lowman E.W., Gibson J.: Wound healing in the paraplegic patient. Surgery 44: 625-626, 1961.
8. Muren A.: Wound healing after denervation. Acta Physiol Scand 111 (30 Suppl): 148-151, 1954.
9. Sandberg N., Zederfeldt B.: Delated effect of denervation on the healing of skin incisions in the rabbit. Acta Chir Scand 121: 111-117, 1961.
10. Adams R.D., Fitzpatrick T.B., Eisen A.Z., et al: "Neurocutaneous diseases". In: Dermatology in general medicine. New York, McGraw-Hill, p. 2022- 2062, 1987.
11. Stover S.L., Gay R.E., Koopman W., et al: Dermal fibrosis in spinal cord injury patients, a scleroderma variant? Arthritis Rheum 23: 1312-1317, 1980.
12. Stover S.L.: Arthritis related interests in spinal cord injury. J Rheumatol (Suppl 14): 82-89, 1987.
13. Mascis Protocol. September 17: 1-29, 1998.
14. Basso D.M., Beattie M.S., Bresnahan J.C.: Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp Neurol 139: 244-256, 1996.
15. Vialle E., Vialle L.R., Rasera E., et al: Avaliação da recuperação motora em ratos submetidos a lesão medular experimental. Rev Bras Ortop 37: 83-88, 2002.
16. Vialle E., Vialle L.R., Cechinel C., et al: Comparação da recuperação motora em ratos submetidos a lesão medular experimental com traumas de diferente energia. Coluna 1:79-82, 2002.
17. Anderson T.E.: Spinal cord contusion injury: experimental dissociation of hemorrhagic necrosis and subacute loss of axonal conduction. J Neurosurg 62: 115-119, 1985.
18. Allen A.R.: Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. Preliminary report. JAMA 57: 878-880, 1911.
