1. Residente do 3o ano do Programa de Residência Médica em Ortopedia e Traumatologia do Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital e Maternidade Angelina Caron - Campina Grande do Sul (PR), Brasil.
2. Preceptora do Programa de Residência Médica de Ortopedia e Traumatologia do Hospital e Maternidade Angelina Caron - Campina Grande do Sul (PR), Brasil.
3. Chefe do Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital e Maternidade Angelina Caron - Campina Grande do Sul (PR), Brasil.
4. Residente do 2o ano do Programa de Residência Médica em Ortopedia e Traumatologia do Serviço de Ortopedia e Traumatologia do Hospital e Maternidade Angelina Caron - Campina Grande do Sul (PR), Brasil.
Endereço para correspondência: Rodovia do Caqui, 1.150, Bairro Araçatuba - 83430-000 - Campina Grande do Sul, PR. Tel.: (41) 3679-8288.
E-mail: repka@hospitalcaron.com.br
Envelhecer é um processo contínuo, progressivo, impossível de controlar e comum a todos os seres vivos. É atribuído a vários fatores e o mais aceito é a existência de um número máximo, finito e imutável de replicações celulares em quase todos os tecidos, o que limita sua renovação ou mesmo a sua cicatrização quando necessária(1).
O envelhecimento médio populacional mundial tem sofrido aumento nos últimos anos como conseqüência da maior e melhor atenção aos idosos, permitindo sua maior sobrevida. No Brasil, estima-se que em 2025 a proporção atinja 14%, embora seja inferior à média estimada de 25% para os países europeus(2-3).
O diabetes mellitus (DM) é um problema de importância crescente na saúde pública em vários países do mundo, levando ao comprometimento tanto da produtividade, quanto da qualidade de vida e sobrevida do indivíduo. No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, há uma população estimada em 4,9 milhões de adultos diabéticos e terá aproximadamente 11,9 milhões em 2025. De acordo com o Consenso Brasileiro sobre Diabetes 2003(4), o DM crônico provoca alterações microvasculares, as quais levam à diminuição do aporte sanguíneo aos tecidos, logo diminuindo a perfusão de oxigênio e então ocasionando complicações crônicas como nefropatias, retinopatias, neuropatias, úlceras plantares e amputações, artropatia de Charcot e manifestações de disfunção autonômica, incluindo disfunção sexual. No tecido ósseo, pode ocasionar osteopenias e alterar o processo de osteogênese de uma fratura.
Apesar dos vários estudos desenvolvidos sobre o processo do envelhecimento, são poucos os que o associam ao diabetes e ambos à cicatrização óssea. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade histológica do calo ósseo de ratos idosos diabéticos após a indução de fraturas expostas diafisárias na tíbia.
MÉTODOS
Delineamento experimental
Foram adotados como normatizações os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e a Lei Federal no 6.638 (1979)*. Para a sua execução seguiu-se o planejamento previsto no diagrama da figura 1 e as aferições aplicadas nos ratos foram: avaliação ponderal, dosagens de glicemias e hemoglobinas glicosiladas (HbA1c), avaliações radiográficas e histológicas dos calos ósseos.
Caracterização da amostra
A amostra foi composta por 20 ratos machos, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), com 40 dias de vida, separados em dois grupos. Esses animais foram mantidos no biotério por 430 dias até atingir a idade média de 359,2 ± 13,98 dias, então considerados idosos(5). A seguir, foram separados em dois grupos com 10 ratos cada, "idosos-normais" (GIN), submetidos à inoculação de solução tampão citrato pH 4,0 e "idosos-diabéticos" (GID), sendo estes submetidos à inoculação de estreptozotocina. Após 24 horas foram feitas as aferições: pesagens dos animais, dosagens de glicemias e hemoglobinas glicosiladas (HbA1c). Ambos os grupos foram mantidos por 150 dias e, então, procedeu-se às fraturas padronizadas, no terço médio da tíbia esquerda e foram repetidas as mesmas aferições. Na seqüência, foram mantidos por mais 21 dias, até a eutanásia e coleta de amostras para a histopatologia do calo ósseo.
Ambiente de experimentação
Os ratos foram alojados em grupos de cinco, em caixas de polipropileno, adequadas para a espécie, devidamente identificadas; cada animal também foi identificado com marcas permanentes feitas na pelagem. O ambiente dispunha de temperatura controlada entre 19 e 22ºC e ciclos claro/escuro automaticamente regulados em 12 por 12 horas.
Receberam ração específica para a espécie (Nuvilab-Nuvital®) e água, ad libitum. Os dejetos eram retirados e as caixas substituídas a cada 48 horas, conforme normas do biotério onde foi realizado o estudo.
Indução do diabetes
A indução do diabetes foi feita pela inoculação de estreptozotocina (Sigma® S-0130), solubilizada em solução tampão citrato pH 4,0 e inoculada na dose de 90mg/kg por via intraperitoneal(6). Após 24 horas da inoculação foram feitas dosagens de glicemia por método capilar, através de punção na cauda (Advantage-Boehringer Mannheim®). Os animais foram mantidos por cinco meses (150 dias), no mesmo ambiente anteriormente descrito.
Após esses procedimentos, os animais foram relocados no biotério e receberam dipirona por via oral, diluída na água (90mg/ml) por três dias e foram mantidos nas mesmas condições pré-operatórias.
Aferições
Avaliação ponderal
Os ratos foram pesados em balança analítica (Ohaus MB 35 Mettler®).
Produção de fraturas
Decorridos cinco meses após a indução de diabetes, os ratos foram novamente pesados e submetidos às dosagens de glicemia e hemoglobina glicosilada. Nesse dia, todos os ratos foram anestesiados por via intramuscular, com 50mg/kg de cetamina (Ketamin-Cristalia®) associada a 7,5mg/kg de xilasina (Calmiun-Agener União®)(7). A seguir, foram executadas tricotomias dos membros posteriores esquerdos e anti-sepsia com polirrovidona (PVPI) degermante.
Procedeu-se a acesso cirúrgico ântero-medial de aproximadamente 0,5cm, no terço médio da tíbia esquerda, com divulsão das partes moles e exposição da diáfise (figura 2). Com auxílio de cisalha, foi produzida uma fratura na diáfise da tíbia esquerda de cada rato, sempre pelo mesmo pesquisador e, a seguir, sutura da pele com dois pontos simples separados, com fio mononáilon 4.0 (Ethicon - Johnson-Johnson®).
Avaliação radiográfica
Foi executada em todos os ratos imediatamente após a produção das fraturas para avaliar o tipo (figura 3) e, no 21o dia de evolução, para avaliar a persistência do traço e a qualidade do calo ósseo. Utilizaram-se equipamento Diagnost 15 MXGPhillips® Medical System e película radiológica Kodak® 24 x 30cm.
No 21o dia, os animais foram novamente anestesiados conforme anteriormente descrito e procedeu-se às dosagens de glicemia por método capilar, coletaram-se amostras de sangue para as dosagens de hemoglobina glicosilada e também foram feitas radiografias dos membros posteriores esquerdos. A seguir, ainda sob plano anestésico, foram desarticulados os membros posteriores esquerdos para avaliação histológica da cicatriz óssea e receberam inoculação de tiopental sódico (Tiopentax - Cristalia®) na dose de 300mg/kg para a indução de parada cardiorrespiratória.
Dosagem de glicemia
Em ambos os grupos de estudo realizaram-se as dosagens das glicemias por método da glicose-oxidase (Advantage-Boehringer Mannheim®) com amostras de sangue obtidas por punção na cauda, nos períodos de 24 horas e após cinco meses da inoculação de estreptozotocina e solução fisiológica (data da produção das fraturas) e na data da eutanásia (21 dias após a produção das fraturas).
Dosagem de hemoglobina glicosilada (HBA1c)
Essa dosagem, determinada por cromatografia líquida em amostras de sangue obtidas por punção intracardíaca, foi feita em ambos os grupos, cinco meses após a inoculação de estreptozotocina e solução tampão citrato pH 4,0 e na data da eutanásia(8).
Análise histológica dos calos ósseos
Após a desarticulação dos membros posteriores esquerdos, as tíbias foram dissecadas, preservando-se o envoltório de partes moles adjacente ao calo ósseo. A seguir, as peças foram fixadas em formaldeído a 10% durante cinco dias.
Após a fixação, os fragmentos foram descalcificados em ácido nítrico a 5% por mais cinco dias, desidratados em álcool e incluídos em parafina. Foram realizados cortes de 5µm e confeccionadas lâminas coradas pela hematoxilina-eosina (HE)(9) e Alcian Blue (AB), coloração específica para proteoglicanos, os quais refletem a atividade condrogênica, classificada como ausente, discreta, moderada ou abundante. A ausência de proteoglicanos refletia a baixa atividade condrogênica nos calos ósseos maduros; a atividade condrogênica abundante, indicada pela elevada quantidade de proteoglicanos, refletia reparo tecidual ainda em fase inflamatória(10).
Análise microscópica
A análise foi realizada sob microscopia óptica (Zeiss®, Axiostar Plus); o estágio do reparo ósseo foi determinado por dois patologistas em seqüência aleatória das lâminas, sem conhecimento do grupo a que pertenciam os animais.
Para as avaliações dos cortes corados pela HE foram adotados os critérios histológicos(11), os quais organizam o processo de consolidação das fraturas em quatro fases. 1) fase fibroblástica: 1a semana; 2) fase cartilaginosa ou colágena: 2a semana; 3) fase osteogênica: 3a e 4a semanas; 4) fase de ossificação com osso imaturo ou remodelação: 5a e 6a semanas. Esses critérios foram associados à proposta de Allen et al(12), conforme escala de cinco pontos (tabela 1) como parâmetros para classificação da fase de consolidação da fratura.
Análise estatística
Foi utilizado o teste t de Student, com índice de significância de 0,05 para rejeição da hipótese nula. Também foi utilizada regressão linear para obtenção do índice de correlação r entre as dosagens de glicemia e hemoglobina glicosilada no grupo idosos-diabéticos.
RESULTADOS
Óbitos e intercorrências
Durante o período de cinco meses após a indução de diabetes, não houve óbitos ou outras intercorrências nos ratos de ambos os grupos. Contudo, os ratos do grupo GID chegaram ao término desse período com perda significante de peso e quatro desses (40%) apresentavam velamento de retina em ambos os olhos. No período de evolução das fraturas ocorreram dois óbitos entre os ratos do grupo GIN.
Avaliação ponderal
A avaliação ponderal dos ratos idosos-normais (GIN) demonstrou que durante o período de cinco meses, após ter sido inoculados com solução tampão citrato pH 4,0, os ratos tiveram ganho significante de peso (gráfico 1). No início desse período (T0) a média foi de 397,2 ± 14,4 gramas, diferindo da média no quinto mês, que foi de 490,4 ± 10,1 gramas, com p < 0,05 entre essas médias (tabela 2).
A avaliação ponderal dos ratos idosos-diabéticos (GED) demonstrou que durante o período de cinco meses, após a inoculação de estreptozotocina e comprovação da indução de diabetes, os ratos tiveram perda significante de peso (gráfico 2). No início desse período (T0), a média foi de 403,2 ± 13,3 gramas, diferindo da média no quinto mês, que foi de 277,5 ± 35,0 gramas, com p < 0,05 entre essas médias (tabela 2).
Avaliação radiográfica
A avaliação radiográfica dos focos fraturários de todos os ratos de ambos os grupos foi executada imediatamente após a produção das fraturas. Demonstrou em 100% desses a ocorrência de fraturas oblíquas, curtas e completas no terço médio das tíbias e ao 21o dia de evolução, formação de calo ósseo, sendo maior no grupo GIN quando comparada com o grupo GID.
Dosagens de glicemias
As médias das dosagens de glicemias executadas nos dois grupos de ratos demonstraram diferenças significantes, conforme apresentado no gráfico 3. O grupo idosos-diabéticos apresentou médias superiores às do grupo idosos-normais nas 24 horas após a inoculação de estreptozotocina. Cinco meses após a indução do diabetes, o grupo idosos normais apresentou glicemia média de 532,9 ± 64,0mg/dl, tendo como valores iniciais, imediatamente após a indução do diabetes pela estreptozotocina, 498,16 ± 36,2g, com p > 0,05. Os ratos mantiveram-se diabéticos durante cinco meses.
Dosagens de hemoglobina glicosilada (HBA1c)
As dosagens de hemoglobina glicosilada no grupo GIN demonstraram valor médio de 3,85% ± 0,92 e os ratos do grupo GID, mantidos com diabetes por cinco meses, apresentaram média de 18,86% ± 3,4, o que confirma a manutenção da hiperglicemia por período prolongado.
Nesse grupo de ratos a análise de regressão linear mostrou coeficiente de correlação r = 0,8299 entre as dosagens de hemoglobina glicosilada e as glicemias, no final do quinto mês de evolução, após a inoculação da estreptozotocina (gráficos 4 e 5).
Análise histológica
Idosos-normais (GIN)
Avaliação pela coloração hematoxilina-eosina:
Foi observado que um rato (12,5%) apresentou padrão osteogênico completo (grau 4); outro rato (12,5%), padrão osteogênico incompleto (grau 3); e seis ratos (75%), padrão misto, com achados histológicos característicos do padrão cartilaginoso completos e do padrão osteogênico incompleto, com predomínio de achados do padrão osteogênico incompleto grau 3 (figura 5).
Avaliação pela coloração Alcian-Blue:
Foi observada em cinco ratos (62,5%) quantidade moderada de proteoglicanos e, em três ratos (37,5%), quantidade discreta (figura 6).
Idosos-diabéticos (GID)
Avaliação pela coloração hematoxilina-eosina:
Não foi observado em nenhuma das amostras o padrão osteogênico completo (grau 4). Em três ratos (30%) foi caracterizado o padrão osteogênico incompleto (grau 3). Em outros três (30%), o padrão cartilaginoso completo (grau 2) e, em dois (20%), o padrão misto, com características histológicas do padrão cartilaginoso completo e também do osteogênico incompleto, havendo predomínio do padrão cartilaginoso completo (grau 2). Nos demais ratos desse grupo, 20% (n = 2) apresentaram padrão misto entre cartilaginosos incompleto e completo com predomínio do cartilaginoso completo (grau 2) (figura 4).
Avaliação pela coloração Alcian-Blue:
Foi observada em seis ratos (60%) quantidade moderada de proteoglicanos e, em quatro ratos (40%), quantidade discreta (figura 6).
DISCUSSÃO
Apesar de não haver consenso na literatura sobre o conceito de rato idoso, para desenvolver o presente modelo experimental, levou-se em conta que um rato Wistar vive em média dois anos e meio, equivalentes a 900 dias, e podem ser consiparâderados idosos ao atingir 70% ou mais dessa idade(5,13). Neste estudo foi utilizado o rato como modelo animal de experimentação por ser de custo e manejo acessíveis, possível uniformização da amostra e ciclo curto de vida. Por esses motivos, foram selecionados ratos Wistar com 40 dias, que foram mantidos por 470 dias, os quais sofreram a indução de diabetes pela estreptozotocina e permaneceram diabéticos por mais 150 dias, perfazendo o total de 620 dias. Nessa condição de faixa etária e tempo de diabetes, foram submetidos à indução de fraturas na tíbia e mantidos por mais 21 dias. Assim sendo, esses ratos acumularam ao final do estudo a idade de 641 dias, idade esta equivalente a 75% do seu ciclo de vida e portadores de diabetes, conforme descrito no diagrama da metodologia adotada neste estudo.
Em ratos é possível a indução de diabetes pela pancreatectomia total ou pela administração de drogas diabetogênicas como aloxana, ditizona, anticorpos antiinsulina ou estreptozotocina. A estreptozotocina é agente quimioterápico utilizado no tratamento de tumores carcinóides e endócrinos do pâncreas. Atua por meio da diminuição da ação da adenina-nicotinamida das células betapancreáticas, inibindo a síntese de DNA pelas células beta das ilhotas de Langerhans(14) e, conseqüentemente, bloqueando de forma irreversível a produção de insulina e causando grave hiperglicemia e induzindo, assim, diabetes mellitus (DM) análogo ao diabetes tipo I em humanos(15). Conforme demonstrado no gráfico 1, o grupo de ratos idosos normais, que foram inoculados com solução tampão citrato pH 4,0, teve ganho de peso durante o período de 150 dias. Iniciaram esse período com 397,2 ± 14,4g e no quinto mês atingiram 490,4 ± 10,1g, sendo considerado o grupo controle deste estudo. Os ratos idosos diabéticos, ao contrário dos anteriores, tiveram perda significante de peso, pois ao início desse período demonstravam média de 403,2 ± 13,3g e no quinto mês a média foi de 277,5 ± 35,0g. Essa perda de peso pode seguramente ser atribuída ao diabetes induzido, pois as médias de glicemias e de hemoglobina glicosilada A1c foram significantemente diferentes nesses grupos, conforme demonstrado no gráfico 2. A hemoglobina glicosilada A1c é o parâmetro laboratorial utilizado para a monitorização do diabetes por se tratar de um processo molecular no qual a glicose se incorpora à HBA somente quando a hiperglicemia é mantida elevada durante os três meses precedentes(8). No presente estudo houve correlação significante com r = 0,8299 entre as dosagens de glicemia e hemoglobina glicosilada (gráfico 5), o que confirma a cronificação do diabetes nos animais do grupo GID.
Com a cronicidade do DM, haverá o aparecimento de alterações micro e macrovasculares e, inclusive, osteopenia, sendo esta o resultado do pobre controle de anormalidades metabólicas e o grau de perda óssea é relacionado à magnitude da glicosúria, da concentração da glicemia e da hemoglobina glicosilada(16). Foi observado que o aumento da concentração de glicose, como o observado em pacientes com DM, provoca elevação das taxas de glicação, que é o acúmulo cruzado dos derivados de glicose nas fibras colágenas(17). Tecidos ricos em colágenos, dentre eles os ossos, são altamente vulneráveis ao processo de glicação que ocorre no diabetes durante o envelhecimento, sendo descritas evidências de que o óxido nítrico (NO) não somente inibe a atividade osteoclástica, mas também é um moderador ou inibidor da atividade osteoblástica(18). Com a perda ou diminuição das concentrações do NO há a redução da reabsorção óssea(19). Ao ocorrer a diminuição do NO, há aumento da atividade osteoclástica e diminuição da atividade osteoblástica contribuindo para o aumento da osteopenia no DM induzido em ratos. O balanço negativo do cálcio, aceleração e diminuição no estado de substituição óssea, alterações metabólicas da vitamina D e anormalidades do colágeno têm sido implicados na patogênese do mecanismo da osteopenia diabética(20).
O decréscimo da massa óssea está relacionado à produção de defeito do colágeno tipo II e diminuição da produção do colágeno tipo X, o qual normalmente se encontra aumentado nos processos de calcificação do calo ósseo fraturário(21). O colágeno tipo II está relacionado com a diferenciação dos condrócitos e o tipo X, na proliferação dos condrócitos na matriz extracelular. Ocorrendo a alteração desse processo de proliferação e de diferenciação dos condrócitos, poderá ocorrer a interrupção ou o impedimento do processo de reparo de fratura. Em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina e ratos do grupo controle, ambos com fraturas femorais, foram observadas diferenciações significantes na expressão do colágeno tipo II e tipo X, com diminuição predominante do colágeno tipo X. Histologicamente, com as alterações do colágeno ocorre retarde no aparecimento e na maturação dos condrócitos no calo dos ratos diabéticos. Essa mudança biobiológica durante o processo de cura da fratura diminui a força mecânica dos ossos longos, podendo provocar a falha na cura da fratura (retarde de consolidação ou pseudartrose)(22).
Foi observado em ratos diabéticos sob uso regular da insulinoterapia e controle do DM a normalização da fase condrogênica nos tratados(23). No DM induzido em ratos foi observada a redução significante da capacidade do osso em absorver energia quando submetidos a forças de tensão(24). Foram demonstradas evidências da presença de fatores angiogênicos no hematoma fraturário humano. O restabelecimento da anatomia vascular é um dos eventos precoces que ocorrem durante a osteogênese(25), sendo este um dos fatores de atraso na consolidação das fraturas em ratos diabéticos, pois ocorre prolongamento da fase de hematoma(26). Os osteoblastos produzem derivados de fatores de crescimento ósseo e diferenciação celular, que são polipeptídeos de baixo peso molecular, os quais estão incorporados à matriz extracelular durante o processo da formação óssea. Dentre os fatores de crescimento podem destacar-se a superfamília dos TGF b, IGF I e II, FGF, PDGF, BMP, as interleucinas 1, 3 e 6 e o fator de necrose tumoral alfa. No momento em que o trauma ocorre ou quando há o remodelamento ósseo, esses fatores são liberados e regulam o metabolismo osteoblástico-osteoclástico, podendo iniciar e controlar a resposta de remodelamento(27).
No presente estudo, verificou-se atraso da consolidação óssea quando foram comparados os ratos idosos diabéticos e idosos normais, ocorrendo diferenciação importante na avaliação histológica da cicatrização óssea. Utilizando como parâmetro as fases de consolidação da fraturas de Allen et al(12), observou-se predomínio de tecido osteogênico nos ratos GIN (89%) e predomínio de tecido cartilaginoso (70%) nos GID.
Não houve diferença na quantidade de proteoglicanos nos grupos GIN e GID, tendo sido evidenciado em ambos os grupos padrão histológico misto dos calos ósseos pela coloração de Alcian Blue. Esses resultados podem ser comparados aos de Topping et al(21), que observaram a existência de colágeno defeituoso do tipo II nos calos ósseos de ratos diabéticos.
CONCLUSÃO
O diabetes mellitus induzido pelo estreptozotocina retarda o processo de maturação do calo fraturário em ratos idosos.
2. Ramos LR, Veras RP, Kalache A. Envelhecimento populacional: uma realidade brasileira. Rev Saúde Pública. 1987;21(3):211-24.
3. Monteiro MFG, Alves MIC. Aspectos demográficos da população idosa no Brasil. In: Veras RP, organizador. Terceira Idade: um envelhecimento digno para o cidadão do futuro. Rio de Janeiro: Relume-Dumara; 1995. p. 65-78.
4. Sociedade Brasileira de Diabetes. Conceito. In: Sociedade Brasileira de Diabetes. Consenso Brasileiro sobre Diabetes 2002. Diagnóstico e classificação do diabetes melito e tratamento do diabetes melito tipo 2. Rio de Janeiro: Diagraphic Editora; 2003. p.5-6.
5. Gerstein AD, Phillips TJ, Rogers GS, Gilchrest BA. Wound healing and aging. Dermatol Clin. 1993;11(4):749-57. Review.
6. Weide LG, Lacy PE. Low-dose streptozotocin-induced autoimmune diabetes in islet transplantation model. Diabetes. 1991;40(9):1157-62.
7. Bacelar Júnior JC. Avaliação da ação das drogas hidrato de cloral, cetamina/xilazina e tiopental na anestesia em ratos [tese]. Curitiba: Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná; 1999. p. 49.
8. Watanabe T, Kato K, Yamada D, Midorikawa S, Sato W, Shiga M, et al. A nondiabetic case of hemoglobin variant (Hb Niigata) with inappropriately high and low HbA1c titers detected by different methods. Clin Chem. 1998;44(7):1562-4.
9. Buckwatter JA. Healing of musculoskeletal tissues. In: Rockwood CA, Green DP editors. Fractures in adults. 4th ed. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1996, p.181-222.
10. Carvalho EM, Cavalcante MA, Oliveira LP, Elias N, Mesquita KC. Efeitos da desnervação periférica sobre a formação do calo ósseo: estudo experimental em ratos. Rev Bras Ortop. 1993;28(9):683-6.
11. Udupa KN, Prasad GC. Chemical and histochemical studies on the organic constituents in fracture repair in rats. J Bone Joint Surg Br. 1963; 45:770-9.
12. Allen HL, Wase A, Bear WT. Indomethacin and aspirin: effect of nonsteroidal anti-inflammatory agents on the rate of fracture repair in rat. Acta Orthop Scand. 1980;51(4):595-600.
13. Ashcroft GS, Horan MA, Ferguson MW. Aging is associated with reduced deposition of specific extracellular matrix components, an upregulation of angiogenesis, and an altered inflammatory response in murine incisional wound healing model. J Invest Dermatol. 1997;108(4):430-7.
14. Mendez JD, Ramos HG. Animal models in diabetes research. Arch Med Res. 1994;25(4):367-75. Review.
15. Carvalho EN, Carvalho NAS, Ferreira LM. Experimental model of induction of diabetes mellitus in rats. Acta Cir Bras. 2003;18(N Spe):60-4.
16. McNair P, Madsbad S, Christiansen C, Christensen MS, Faber OK, Binder C, Transbol I. Bone loss in diabetes: effects of metabolic state. Diabetologia. 1979;17(5):283-6.
17. Reddy GK. Glucose-mediated in vitro glycation modulates biomechanical integrity of the soft tissues but not hard tissues. J Orthop Res. 2003;21(4):738-43.
18. Mancini L, Moradi-Bidhendi N, Becherini L, Martineti V, MacIntyre I. The biphasic effects of nitric oxide in primary rat osteoblasts are cGMP dependent. Biochem Biophys Res Commun. 2000;274(2):477-81.
19. Kasten TP, Collin-Osdoby P, Patel N, Osdoby P, Krukowski M, Misko TP, et al. Potentiation of osteoclast bone-resorption activity by inhibition of nitric oxide synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(9):3569-73.
20. Seino Y, Ishida H. Diabetic osteopenia: pathophysiology and clinical aspects. Diabetes Metab Rev. 1995;11(1):21-35.
21. Topping RE, Bolander ME, Balian G. Type X collagen in fracture callus and the effects of experimental diabetes. Clin Orthop Relat Res. 1994; (308):220-8.
22. Gooch HL, Hale JE, Fujioka H, Balian G, Hurwitz SR. Alterations of cartilage and collagen expression during fracture healing in experimental diabetes. Connect Tissue Res. 2000;41(2):81-91.
23. Beam HA, Parsons JR, Lin SS. The effects of blood glucose control upon fracture healing in the BB Wistar rat with diabetes mellitus. J Orthop Res. 2002;20(6):1210-6.
24. Reddy GK, Stehno-Bittel L, Hamade S, Enwemeka CS. The biomechanical integrity of bone in experimental diabetes. Diabetes Res Clin Pract. 2001;54(1):1-8.
25. Street J, Winter D, Wang JH, Wakai A, McGuinness A, Redmond HP. Is human fracture hematoma inherently angiogenic? Clin Orthop Relat Res. 2000;(378):224-37.
26. Padula EOC, Andrade ML, Giordano V, Ramalho MV. Aspectos morfológicos do processo de consolidação de fratura em ratos diabéticos. Rev Bras Ortop. 2003;38(3):127-36.
27. Mohan S, Baylink DJ. Bone growth factors. Clin Orthop Relat Res. 1991; (263):30-48.
