Trabalho realizado com apoio CAPES.
1. Médico Veterinário, Mestre e Doutor pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
2. Professor Titular do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: José B. Volpon, Rua São José, 655, apto. 901 - 14010-160 - Ribeirão Preto (SP) - Brasil. Tel./fax: (16) 3633-3063.
E-mail: jbvolpon@fmrp.usp.br
A maior incidência de traumatismos de alta energia e o conseqüente aumento na incidência de anomalias do processo de consolidação das fraturas tornaram-se um dos grandes desafios da ortopedia. Muito tem sido tentado no sentido de se investigarem novas técnicas de enxertia óssea, mas o próprio osso ainda constitui o método mais eficiente e tradicional de terapêutica. O enxerto ideal é o autólogo, que pode apresentar limitações em relação ao uso, quando há necessidade de reconstrução de grandes segmentos, ou quando a fonte doadora é escassa(1).
Um caminho natural é a busca de métodos de preservação de enxerto homólogo e a constituição de bancos de ossos. Nesses casos, a variação é grande com relação aos tipos de enxerto, ao osso utilizado - se cortical, esponjoso ou misto - ao formato, ao método de fixação, ao tipo de preparo, bem como à estocagem(2-3). O ideal é que o enxerto tenha resistência mecânica, seja de preparo simples, de suficiente disponibilidade, de baixo custo, de fácil estocagem e transporte, além de apresentar boa capacidade osteogênica e de incorporação, sem reações de rejeição(4-5).
Não há um enxerto que contemple todas essas propriedades simultaneamente e diferentes tipos deles podem ser usados, conforme necessidades específicas. Os enxertos homólogos podem ser utilizados frescos, congelados em temperatura variando de -60º a -80ºC, liofilizados, ou após algum preparo especial(6).
Volpon e Costa apresentaram resultados clínicos com o uso de um enxerto corticoesponjoso homólogo com preparação que envolvia a retirada da gordura, desidratação, esterilização em óxido de etileno, embalagem e estocagem em temperatura ambiente que, teoricamente, apresenta várias das propriedades descritas, bem como bom desempenho biológico e clínico, embora suas condições de utilização tenham sido restritas a cirurgias ortopédicas em crianças(7).
Castania e Volpon estudaram laboratorialmente esse tipo de enxerto, principalmente do ponto de vista de resistência mecânica, e verificaram que, em geral, o processo de tratamento diminuiu a resistência do osso, o que, em tese, limitaria sua utilização, quando maior solicitação mecânica local fosse necessária, seja para a fixação de implantes, seja para suporte das próprias cargas locais. Entretanto, no mesmo trabalho, os autores verificaram que o enxerto apresentou boa integração quando estudado do ponto de vista radiográfico(5).
Assim, o objetivo da presente pesquisa foi aprofundar o estudo desse tipo de enxerto e avaliar, experimentalmente, seu desempenho biológico e capacidade de integração.
MÉTODOS
Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética e Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP. Todo o procedimento foi realizado no Laboratório de Bioengenharia da mesma faculdade.
Foram utilizados cães adultos saudáveis (Canis familiaris), mestiços, de ambos os gêneros, com peso corporal entre 12 e 25kg. Desses animais doadores, blocos cilíndricos foram retirados transversalmente da epífise distal dos fêmures com o uso de trefina de 1,0cm de diâmetro interno, acoplada a um perfurador operando em baixa rotação e recortado para 1,0cm de altura. Os blocos ósseos foram conservados e processados, conforme técnica descrita por Volpon e Costa(7): depois da retirada dos resquícios de partes moles aderidas, os blocos ósseos foram mantidos em álcool absoluto por dois dias, tratados em água oxigenada (40v) até o clareamento do osso e, depois, banho com éter etílico, com trocas sucessivas até o desaparecimento de gotículas de gordura sobrenadantes. O material foi mantido em álcool absoluto por 48 horas, secado em estufa (60º); os blocos ósseos foram embalados individualmente e esterilizados em óxido de etileno, com técnica hospitalar rotineira. A estocagem foi em temperatura ambiente e o uso não excedeu seis meses em relação ao período de esterilização.
Os animais receptores tiveram as mesmas características somáticas que os doadores e foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos.
No grupo I (enxerto homólogo), 10 cães foram operados. Foram pré-anestesiados com acetilpromazina, na dose de 0,1mg/kg de peso corporal e submetidos à anestesia epidural com bupivacaína 0,5%, (2,0mg/kg de peso corporal), combinada com aplicação endovenosa de Tiopental® na dose de 15,0mg/kg de peso. Após tricotomia e sob condições rotineiras de assepsia e anti-sepsia cirúrgicas, a extremidade distal do fêmur direito foi abordada por acesso medial e a superfície óssea exposta. Com trefina, foi retirado um bloco ósseo, no sentido transversal, de modo a produzir uma cavidade cilíndrica de 1,0cm de diâmetro e 1,0cm de profundidade.
Com auxílio de agulha 40 x 16 foi feita a punção da crista ilíaca, previamente preparada, e obtidos 10,0ml de aspirado de medula óssea que, juntamente com três gotas de EDTA, foram usados para embeber o enxerto ósseo homólogo preparado que, em seguida, foi encaixado sob pressão no leito receptor. A incisão foi suturada, o curativo feito e não houve imobilização. Os animais foram tratados com enrofloxacina (5,0mg/kg), tramadol (4,0mg/kg) e, mais tarde, com ketoprofeno (2,0mg/kg) intramuscular como analgésico, por três dias. No sexto dia após a cirurgia, o joelho operado foi radiografado em perfil para avaliação do posicionamento do implante.
Após três semanas, os mesmos animais foram operados no outro fêmur (esquerdo), seguindo o mesmo protocolo; seis semanas após foram sacrificados com dose excessiva de tiopental seguida da injeção endovenosa de solução saturada de KCl; seis dias antes do sacrifício, os animais receberam uma aplicação de oxitetraciclina na dose de 30mg/kg de massa corporal, via endovenosa, para a marcação do osso neoformado. Assim, no mesmo animal, do lado direito foi possível estudar o enxerto após seis semanas e, no lado esquerdo, após três semanas de implantação.
O grupo II constituiu o controle e foi composto por 20 animais que receberam, em uma mesma sessão cirúrgica, enxerto autólogo retirado do fêmur esquerdo e inserido no fêmur direito, com a mesma técnica já descrita, exceto que não houve uso da medula óssea. A cavidade no lado doador não foi preenchida. Desse grupo foram criados dois subgrupos: um sacrificado três semanas após a cirurgia (subgrupo A) e, o outro, sacrificado seis semanas após (subgrupo B). Assim, também foi possível obter material para análise nos mesmos tempos que no grupo que recebeu o enxerto homólogo. Todos os animais foram radiografados logo após a eutanásia. A figura 1 ilustra os principais passos técnicos da cirurgia.
Após a morte dos cães, o terço distal do fêmur foi dissecado, retirado e aparado de modo a produzir um bloco ósseo que continha, no interior, a região do enxerto. Esse material foi seccionado longitudinalmente ao meio; metade foi mantida em formol 4% e destinada à histologia convencional, fornecendo cortes transversais de 10µm de espessura. A coloração foi feita pelo tricrômico azul de alciano-fuccina. A outra metade foi desidratada em álcool absoluto para estudo da fluorescência em luz ultravioleta, conforme técnica básica usada por Volpon(8).
Resumidamente, os espécimes foram colocados em fôrma de silicone e incluídos na resina T208, misturando-se a ela o monômero de estireno e o catalisador. Os blocos apresentavam formato que possibilitou a fixação a uma cortadeira metalográfica, que forneceu fatias regulares de aproximadamente 400µm de espessura, que foram desgastadas manualmente até atingir a espessura de 90 a 100µm e montadas entre lâmina e lamínula com meio de inclusão (Entellan®). Para o estudo da fluorescência óssea, as lâminas foram examinadas em microscópio com epiiluminação por luz ultravioleta.
RESULTADOS
Achados com microscopia de luz comum para os enxertos homólogos e autólogos 21 dias pós-implante
No grupo que recebeu enxerto homólogo, 21 dias pós-implante, os cortes mostravam as áreas do enxerto claramente visíveis e constituídas, na maioria, por trabéculas finas, irregulares sem osteócitos e grandes espaços intertrabeculares preenchidos predominantemente por tecido conjuntivo fibroso, pouco vascularizado (figura 2). Em algumas regiões, o tecido conjuntivo era denso.
Entre os animais, dois apresentavam as trabéculas do enxerto com áreas de deposição de osso neoformado e um animal, um nicho no centro do enxerto composto por área de neoformação óssea por mecanismo endocondral.
A interface enxerto-leito receptor estava preenchida predominantemente por tecido conjuntivo fibroso e, menos vezes, por osso jovem neoformado.
Para os enxertos autólogos, a área do osso implantado era bem visível e constituída por trabéculas de osso antigo mais adelgaçadas e em menor número que o osso receptor, porém, havia intensa deposição de osso neoformado sobre as trabéculas do enxerto, com vascularização e lacunas contendo osteócitos (figura 3). O tecido de preenchimento do espaço intertrabecular era constituído por conjuntivo fibroso. Um animal diferenciou-se dos demais por apresentar intensa ossificação na região do enxerto. Na interface enxerto-osso receptor havia áreas de ossificação endocondral.
Achados histológicos com microscopia de fluorescência para os enxertos homólogos ou autólogos 21 dias pós-implante
Nos animais pertencentes ao grupo dos enxertos homólogos, pôde-se observar fluorescência concentrada na periferia das trabéculas do osso receptor mas, praticamente, sem áreas de fluorescência no enxerto como um todo (figura 4). Elas, quando existiam, estavam localizadas na transição receptorenxerto.
Entretanto, para os enxertos autólogos predominava fluorescência mais esparsa, com depósito sobre as trabéculas e com predomínio na periferia do enxerto, particularmente na transição leito-osso implantado e mesmo no interior do enxerto (figura 5).
Achados histológicos em microscopia de luz comum para os enxertos homólogos e autólogos 42 dias pós-implante
A área do enxerto homólogo era visível, mas já integrada ao osso adjacente e composta ainda por trabéculas antigas com deposição de osso neoformado sobre a superfície. O trabeculado era mais fino, porém mais regular em algumas áreas e ainda irregular, em outras. As trabéculas continham osteócitos (figura 6).
O tecido de preenchimento era predominantemente formado por tecido conjuntivo denso.
Um animal apresentou reabsorção do enxerto e substituição dele por conjuntivo frouxo, sem áreas de osteogênese; em outro, o enxerto estava seqüestrado e constituído por trabéculas finas e irregulares de osso necrótico. O preenchimento era feito por conjuntivo fibroso. Outro animal apresentou a região do enxerto composta quase que totalmente por osso neoformado e com preenchimento intertrabecular com medula óssea.
A região do enxerto autólogo era composta principalmente por osso mais organizado disposto em trabéculas com orientação regular e os espaços intertrabeculares preenchidos por tecido conjuntivo denso em algumas áreas, estroma de medula óssea em outras, com algumas regiões de medula óssea madura (figura 7). Não havia separação nítida da área do enxerto daquela do leito receptor, a não ser pelo tipo trabeculado.
Achados histológicos em microscopia de fluorescência com luz ultravioleta para os enxertos homólogos e autólogos, 42 dias pós-implante
Nos animais com enxertos homólogos, havia intensa fluorescência depositada sobre trabéculas, tanto na região periférica, quanto no interior da área enxertada. Em algumas regiões a fluorescência era difusa, mas diferia da fluorescência mais organizada e correspondente ao leito receptor. Nos casos de enxertos autólogos havia intensa fluorescência que se apresentava de forma mais organizada e com deposição predominante sobre o trabeculado (figura 8).
DISCUSSÃO
A enxertia óssea tem importante papel no tratamento das pseudartroses, do atraso da cicatrização óssea, no preenchimento de cavidades ósseas e nos casos em que ocorre destruição óssea em decorrência de traumatismos ou ressecções tumorais; cada situação clínica requer um tipo de procedimento, com utilização do tipo de enxerto adequado. Um grande problema cirúrgico na enxertia óssea é a limitação de osso apropriado para o transplante(9), o que torna bastante atraente a possibilidade da criação de bancos do osso.
O enxerto autólogo, devido à capacidade osteogênica, facilidade de incorporação e por não apresentar reações imunológicas, é o preferido pelos cirurgiões ortopédicos(10), sendo indiscutível sua superioridade em relação ao enxerto homólogo. Segundo Puranen, o valor biológico de um transplante é baseado na capacidade osteogênica e na qualidade e rapidez de sua organização(11).
Nosso trabalho não visou buscar um substituto ideal para o enxerto autólogo, porém, fornecer uma opção para os cirurgiões que, muitas vezes, deparam situações em que a obtenção do osso autólogo está dificultada ou impossibilitada.
Nossa técnica explora basicamente a atividade osteocondutora do osso corticoesponjoso, visto que, após a sua preparação, todos os elementos osteogênicos são eliminados por ocasião do processamento, restando somente a matriz mineral e o colágeno.
O papel da medula óssea como elemento fornecedor de células osteogênicas é bastante conhecido e referido em trabalhos de diversos autores, entre eles Burchardt(10). Isso motivou-nos a usar, concomitantemente com o osso corticoesponjoso homólogo processado e esterilizado em óxido de etileno, medula óssea colhida pela punção do osso ilíaco do cão receptor. Esse uso teve, também, a finalidade de assemelhar o enxerto processado ao fresco, quanto ao conteúdo de células. O enxerto embebido na medula óssea mantém a ele aderidas células osteogênicas que são transferidas para o leito receptor no ato do implante. A medula autógena é um material livre de componentes imunogênicos que estão presentes em grande quantidade na medula alogênica(11).
Em trabalho metodologicamente semelhante ao nosso, Burwell testou com sucesso o enxerto denominado homólogo-autólogo que, na verdade, era o osso ilíaco homólogo livre do componente medular, preservado e banhado em tecido medular do receptor(12). Da mesma forma, Salama et al, em duas publicações, estudaram o transplante de osso heterólogo, utilizando-se de osso de Kiel e de Oswestry, impregnados com medula óssea do receptor, tentando a estimulação da neo-osteogênese. Suas observações mostravam que a neo-osteogênese parecia ter origem a partir de células da medula óssea que impregnavam o implante(13-14).
Não testamos o implante do enxerto de osso corticoesponjoso homólogo sem o embebimento prévio em medula e, portanto, não pudemos avaliar o efeito da medula óssea na integração do enxerto. Tal procedimento não foi realizado, pois admitimos que o próprio leito receptor pudesse servir de fonte de medula óssea para o enxerto e, com isso, seria difícil separar a ação da medula óssea transferida com o enxerto daquela das adjacências do leito receptor.
Não nos preocupamos em verificar a eficiência da esterilização pelo óxido de etileno, uma vez que utilizamos um único parâmetro de esterilização e não procedemos ao controle bacteriológico pré e pós-esterilização. Entretanto, nosso material foi utilizado segundo a rotina de um hospital que segue rígidos controles de esterilização. Da mesma maneira, não foi possível avaliar a influência do óxido de etileno na incorporação do enxerto, porque não realizamos o implante do enxerto não esterilizado.
A utilização do óxido de etileno na esterilização de enxertos é, ainda, controvertida. Arizono et al(15) relataram efeitos nocivos do óxido de etileno no processo de osteoindução. Segundo esses autores, os principais fatores deletérios são: temperatura em que os ossos são esterilizados, o tempo ao qual ficam expostos à aeração e a presença de resíduos de óxido de etileno pós-esterilização.
Pesquisadores como Moore et al(16) não encontraram interferência do óxido de etileno na propriedade osteoindutiva, mas outros relataram que podem ocorrer mudanças estruturais na superfície óssea e que existe relação dose-dependente na redução das propriedades osteoindutivas(17). Aspenberg et al(18) e Munting et al(19) relataram que o óxido de etileno destrói totalmente a propriedade osteoindutiva. Entretanto, Zhang et al(20) atribuíram à alta temperatura a causa da perda da osteoindutividade. Porém, outros fatores como a liofilização e a desmineralização, se realizadas, com ou sem desengorduramento prévio, também podem interferir na osteoindução(15,20).
Em nosso trabalho procedemos ao desengorduramento do osso com éter etílico, seguido da desidratação em álcool etílico absoluto e ulterior esterilização em óxido de etileno, da mesma forma que nos trabalhos realizados por Volpon e Costa(7) e por Haje et al(21). Como os relatos de literatura referem que o óxido de etileno atua mais na propriedade osteoindutiva e houve remoção de células com essas propriedades, a atuação de nosso enxerto foi, provavelmente, por condução.
Da mesma forma que nos experimentos realizados por Castania e Volpon(5), obtivemos boa incorporação dos enxertos homólogos corticoesponjosos, embora não tivéssemos usado grandes fragmentos ou lesões extensas.
Neste estudo foi realizada apenas uma análise qualitativa do osso implantado, que mostrou que os eventos ocorridos no grupo que recebeu enxerto homólogo foram semelhantes àqueles nos que houve enxertos autólogos, com a diferença de que foram mais atrasados em relação ao tempo. Também, se for levado em consideração que no enxerto processado houve um caso de seqüestração e um de reabsorção, está estabelecida a superioridade do enxerto autólogo. Entretanto, em nossa pesquisa, o enxerto autólogo foi usado como referência, sendo nossa intenção apenas testar a viabilidade do sistema de processamento e integração do transplante.
Os enxertos esponjosos autólogos são osteocondutores e osteoindutores, pois, além de apresentar microarquitetura espacialmente adequada à reabsorção e deposição óssea, carregam células multipotentes da medula e fatores locais de crescimento ósseo, além de, provavelmente, atuarem melhor como elementos estimulantes da reação favorável do hospedeiro, pois não apresentam elementos de antigenicidade(16,22).
O enxerto preparado aqui descrito teve todos seus elementos celulares e enzimáticos destruídos pelo processamento químico e de esterilização e, por isso, deve ter atuado apenas como elemento osteocondutor. A medula óssea autógena que o embebeu teve a finalidade de assemelhá-lo ao enxerto autólogo, com relação ao conteúdo celular, e esse aspecto não investigado na presente pesquisa, provavelmente, agiu favorecendo a osteogênese(12).
CONCLUSÃO
O enxerto homólogo processado e esterilizado em óxido de etileno mostrou boa atividade biológica, com alta taxa de integração, embora inferior à do enxerto autólogo. Assim, não deve ser usado como substituto para esse último, mas como uma alternativa a ele.
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