Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil
A osteoartrose (OA) é a enfermidade articular mais frequente da populac¸ão mundial, com prevalência superior a 10% após os 50 anos, apresenta alterac¸ões histológicas da cartilagem e pode acarretar importantes limitac¸ões funcionais.1,2 A OA é o resultado de vários fatores na disfunc¸ão articular e caracteriza-se por degenerac¸ão da cartilagem e simultânea proliferac¸ão de tecido ósseo, cartilaginoso e conectivo.3 Dentre várias modalidades de tratamento disponíveis atualmente, a terapia com injec¸ões intra-articulares de ácido hialurônico (AH) tem demonstrado efeito benéfico no controle dos sintomas da OA do joelho.4
O AH, um polissacarídeo da família dos glicosaminoglicanos, contribui para a homeostase da articulac¸ão normal e apresenta-se em menor concentrac¸ão e com peso molecular diminuído no líquido sinovial, nas articulac¸ões com osteoartrose.5,6 O AH administrado em forma de injec¸ões intra-articulares pode potencializar os efeitos regenerativos do AH endógeno sobre a cartilagem articular, restituir a viscoelasticidade do líquido sinovial, contribuir para a síntese de AH pelos sinoviócitos e prevenir a degradac¸ão de proteoglicanos e fibras de colágeno da matriz extracelular. Estimula o metabolismo, previne a apoptose dos condrócitos e inibe a degradac¸ão condral e as respostas inflamatórias articulares.6 Atribui-se a esses efeitos da terapia com uso de AH não só a sua capacidade de amenizar os sintomas relacionados à osteoartrose, mas também a sua interferência na progressão da degenerac¸ão articular.5-7
Considerando a abrangência e as implicac¸ões da OA do joelho, compreende-se atualmente a importância do diagnóstico e tratamento em suas fases iniciais, de maneira a minimizar suas consequências.8 Por não haver até o presente momento intervenc¸ões que sejam capazes de inibir sua evoluc¸ão, sobressaem as opc¸ões que permitem a reduc¸ão da sua progressão. Injec¸ões intra-articulares de diferentes tipos de AH poderiam ser usadas com essa finalidade.
Para avaliar os efeitos dessas substâncias na gonartrose, se propôs nesta pesquisa o uso de um modelo experimental de OA que se assemelha àquela observado na espécie humana. A secc¸ão do ligamento cruzado anterior (LCA) do joelho de coelho, a "soldra" (termo usado na anatomia veterinária para a articulac¸ão similar ao joelho humano em pequenos animais como coelhos e cães), mimetiza as alterac¸ões morfológicas e bioquímicas observadas na osteoartrose humana, o que permite a reproduc¸ão acurada dos resultados obtidos.9,10
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das injec¸ões intra-articulares do AH nativo (Polireumin®, TRB Pharma, São Paulo, Brasil) e do AH com cadeias ramificadas (Synvisc®, Novartis, São Paulo, Brasil), separadamente e comparativamente entre si, na OA induzida pela secc¸ão do LCA dos joelhos de coelhos.
Materiais e métodos
Este experimento foi desenvolvido no biotério do curso de pós-graduac¸ão da Universidade Federal do Paraná (UFPR). O Comitê de Ética em Pesquisa do Setor de Ciências da Saúde da UFPR avaliou e aprovou o protocolo de pesquisa usado neste trabalho (Registro CEP/SD: 001.004 SI 06-06).
Foram usados 44 coelhos da rac¸a California, machos, que permaneceram alojados antes e durante os procedimentos, em biotério, em gaiolas, com dois animais em cada uma, com alimentac¸ão padronizada e livre acesso à água. Foram mantidos em controle de luz (ciclo claro-escuro de 12 horas), com temperatura (22 ± 1 ?C), umidade e nível de ruídos mantidos estáveis, com o peso médio de 3,5 kg. Todos os animais inicialmente foram submetidos à ressecc¸ão do LCA. O joelho direito foi escolhido apenas como padronizac¸ão do experimento.
Figura 1 - Foto da incisão cutânea e capsulotomia do LCA.
O procedimento cirúrgico consistiu em anestesia préoperatoriamente com 10 mg/kg de cloridrato de cetamin (Dopalen®) e 50 mg/kg de cloridrato de xilasina (Anasedan®), administrados na mesma seringa, de forma intramuscular (IM), no ventre dos músculos semimembranáceo e semitendíneo do membro posterior direito. Na mesma ocasião foi administrada injec¸ão de 14.400 UI de penicilinas e 6mg de estreptomicinas (Pentabiótico Veterinário Reforc¸ado® - Eurofarma) como antibioticoprofilaxia e Flunamine® (Bayer), na dose de 2,2 mg/kg, por via IM, para analgesia pós-operatória.
O joelho direito foi submetido a tricotomia e a antissepsia com polivinilpirrolidona (Povidini®). Após a aplicac¸ão de campos estéreis, foi feita incisão parapatelar medial na pele e no tecido subcutâneo, seguida de capsulotomia e luxac¸ão lateral da patela (fig. 1). O joelho foi então posicionado em flexão máxima, o que permitiu a visualizac¸ão do ligamento cruzado anterior. Esse foi seccionado com lâmina de bisturi n? 15 (fig. 2), a articulac¸ão foi irrigada com soluc¸ão salina isotônica e procedeu-se à capsulorrafia e sutura da pele com mononáilon 4.0 (fig. 3).
Figura 2 - Foto da exposic¸ão do LCA.
Figura 3 - Foto da sutura da pele.
Um coelho do Grupo 2 e outro do Grupo 3 evoluíram com infecc¸ão do sítio operatório com extensão articular e foram excluídos da pesquisa.
Os coelhos permaneceram alojados nas suas respectivas gaiolas após o ato operatório, sem restric¸ão de apoio aos membros operados. Foram distribuídos randomicamente em três grupos com 14 animais cada um. Decorridas três semanas do procedimento cirúrgico iniciaram-se as respectivas injec¸ões intra-articulares. O volume dos ácidos hialurônicos foi de 0,3 mL, similar ao usado em pequenas articulac¸ões de seres humanos. Grupo P: controle, três infiltrac¸ões com intervalo semanal de soluc¸ão salina isotônica (SF0,9%); Grupo PR: três infiltrac¸ões com intervalo semanal de ácido hialurônico nativo (Polireumin®); Grupo S: três infiltrac¸ões com intervalo semanal de ácido hialurônico ramificado (Synvisc®).
Foram submetidos à eutanásia após 12 semanas do ato cirúrgico. Para isso foram previamente anestesiados como descrito anteriormente e submetidos a injec¸ão intracardíaca de tiopental (5 mL) e cloreto de potássio (10 mL). Os platôs tibiais foram ressecados assepticamente, imersos em frasco contendo formol a 10%. Os frascos foram etiquetados para identificac¸ão dos grupos e enviados ao Servic¸o de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas.
Os platôs tibiais foram descalcificados. Os mediais na área de maior espessura da cartilagem foram submetidos a microtomia no plano sagital para confecc¸ão de três lâminas por platô tibial com o uso das colorac¸ões Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Azul de Toluidina e inclusosemparafina. As lâminas coradas foram enviadas ao Centro Politécnico da Universidade Federal do Paraná no Setor de Ciências Biológicas.
As lâminas histológicas foram digitalizadas automaticamente em um microscópio ZeissImager Z2 Metasystems, com o uso do software MetaferMSearch, com pós-montagem com VSlide. Então, as regiões da cartilagem foram selecionadas com a ferramenta de snapshot do software MetaViewer.
As fotos foram analisadas no software ImageJ, com o uso da ferramenta de RGB Stack para as colorac¸ões Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Color Deconvolution "RGB" para Azul de Toluidina. Posteriormente, a porcentagemde área marcada foi calculada após um threshold seguido de quantificac¸ão.11 Todas as substâncias estudadas foram adquiridas com recursos próprios dos pesquisadores, sem auxílio financeiro externo.
Os dados obtidos foram analisados estatisticamente pela análise de variância fator único (Anova) seguida por testes F e T não pareados, considerados significativos quando p < 0,05. Os gráficos foram construídos com a média de desvio padrão, com o uso do software Microsoft Excel 2007. A avaliac¸ão dos dados foi objetiva, padronizada pelo computador, e subjetiva, pelas notas dadas pelo biólogo responsável pela quantificac¸ão de colorac¸ão no teste qui-quadrado. As notas 1, 2 e 3 foram classificadas como ruim, intermediário e excelente.
Resultados
As lâminas descalcificadas e coradas com Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Azul de Toluidina mostraram a presenc¸a de glicosaminoglicanos em maior quantidade, nos grupos PR (Polireumin®) e S (Synvisc®), quando comparados ao grupo controle P (placebo). Onível de significância usado para todas as análises foi de 5%.
A avaliac¸ão da intensidade de colorac¸ão dos cortes histológicos corados pelo Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Azul de Toluidina pelo aparelho de microscopia ZeissImager Z2 Metasystems gerou resultados que foram dispostos em tabelas e gráficos. A seguir estão os gráficos fornecidos pelo programa, representativos da intensidade real da colorac¸ão mensurada em cada grupo das colorac¸ões citadas anteriormente.
Por meio da análise usada, cada lâmina gerou umdado dentro do conjunto de dados para cada grupo, que foram "P", "PR" ou "S", totalizando 24 lâminas/indivíduos analisados (oito para cada grupo). Para a análise estatística, a hipótese nula (H0) foi: não há diferenc¸a entre as variáveis independentes; a hipótese alternativa (H1): há diferenc¸a entre as variáveis independentes. O valor de alfa usado foi 0,05.
Os valores para cada colorac¸ão estão presentes nas tabelas 1-4. O teste Kolmorogov-Smirnov constatou que os dados
têm uma distribuic¸ão normal (dados não mostrados). Sendo assim, foram usados os testes paramétricos: análise de variância (Anova) fator único e testes t de Student não pareados assumiram variâncias iguais. No teste F foi constatado que as variâncias dos grupos não diferem entre si dentro de uma mesma colorac¸ão. Nas colorac¸ões de Azul de Toluidina e Alcian Blue pH = 2,5, mas não para pH = 1,0, a Anova apontou para uma diferenc¸a estatística significativa (p < 0,05) (dados não mostrados). Sendo assim, para essas duas colorac¸ões com diferenc¸a na Anova foram feitos testes t de Student. Para a colorac¸ão de Azul de Toluidina somente diferiram os grupos P versus PR (tabela 2). Para o Alcian Blue pH = 2,5 diferiram os grupos P versus PR e P versus S, mas esse último somente no unicaudal (tabela 5). Para se testar estatisticamente se de fato há diferenc¸as entre os valores do grupo P e S, foi feita uma análise não paramétrica para variáveis categóricas. Para isso, em vez de se analisarem as lâminas com o uso do software ImageJ, foram dadas notas de 1 a 3 para a intensidade de colorac¸ão, que, quanto maior a nota, mais intensa a colorac¸ão por Alcian Blue pH = 2,5, como descrito anteriormente.12
O teste estatístico usado foi o de qui-quadrado de contingência (2). Para esse teste a H0 foi que os grupos P e S não diferem no padrão de intensidade de colorac¸ão, enquanto que na H1 os grupos P e S são diferentes no padrão de intensidade de colorac¸ão. O n usado foi de 16 (oito para cada grupo de tratamento), alfa de 0,05, grau de liberdade dois e 2 tabelado = 5,991. O 2 calculado foi de 32,14286 (tabela 6). Como o valor do 2 calculado é maior do que o tabelado, rejeita-se H0 e aceita-se a hipótese alternativa.
Discussão
Estudos que comparam a eficiência dos ácidos hialurônicos de diferentes pesos moleculares foram publicados nas últimas décadas. Os dados obtidos são discrepantes por causa de seus resultados e modos de avaliac¸ão.13 Na prática clínica tem-se dado preferência ao ácido hialurônico de alto peso molecular para o tratamento da osteoartrose com base em estudos como os feitos por Atamaz et al.14 e Wobig et al.,15 que usaram o modelo de osteoartrose em humanos, compararam os ácidos hialurônicos de pesos moleculares diferentes com soro fisiológico infiltrado intra-articularmente e obtiveramresultados melhores com o uso dos ácidos hialurônicos de maior peso molecular, emcritérios clínicos e não histológicos.
Entretanto, segundo Karlsson et al.,16 que estudaram ácidos hialurônicos de diferentes pesos moleculares em infiltrac¸ões intra-articulares em humanos com osteoartrose, não ocorreu diferenc¸a significa entre os ácidos hialurônicos de pesos moleculares distintos em critérios clínicos e não histológicos. Essas controvérsias levaramà feitura deste estudo, no qual se comparou o efeito deumhialuronato de alto peso molecular (Synvisc®) com outro de baixo peso (Polireumin®). Para isso usou-se um modelo experimental de osteoartrose.
O modelo experimental em pequenos animais, que mais se assemelha à osteoartrose presente no ser humano, é a transecc¸ão do ligamento cruzado anterior no joelho de coelhos. Mimetiza as alterac¸ões morfológicas e bioquímicas observadas em seres humanos com osteoartrose.5 O coelho foi o animal escolhido por causa do fácil manejo, do menor custo e por ter vasta literatura que ratifica seu uso para os fins de obtenc¸ão de osteoartrose induzida. O prazo do estudo de 12 semanas é relativamente curto para obtenc¸ão de AO, porém é o tempo médio usado na maioria dos estudos encontrados na literatura. A anatomia do joelho do coelho é de fácil dissecc¸ão e visualizac¸ão do ligamento cruzado anterior, o que facilita o procedimento cirúrgico de sua transecc¸ão.9,10,17,18
No presente estudo o manejo com os animais e a dissecc¸ão cirúrgica dos joelhos dos coelhos foram de fácil execuc¸ão. A incisão da pele, a capsulotomia medial com visualizac¸ão do ligamento cruzado anterior e sua transecc¸ão foram de modo rápido e prático. Os platôs dos joelhos submetidos a esse procedimento apresentaramsinais de lesão macroscópica evidente; principalmente os do grupo controle P (placebo-SF 0,9%).19
Colorac¸ões histológicas específicas para glicosaminoglicanos foram escolhidas para avaliar a cartilagem articular por causa da sua alta sensibilidade para detecc¸ão de proteoglicanos. As colorac¸ões Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Azul de Toluidina têm grande capacidade de corar glicosaminoglicanos e proteoglicanos e foram usadas com êxito em vários estudos histológicos de cartilagem.20-23 O Alcian Blue pH = 1,0 cora glicosaminoglicanos de modo geral nos diferentes tecidos; já o Alcian Blue pH = 2,5 e o Azul de Toluidina coram especificamente proteoglicanos.
O uso do microscópio ZeissImager Z2 Metasystems e do software MetaferMsearch permitiu a mensurac¸ão da intensidade de colorac¸ão das lâminas de tecido cartilaginoso.
Obteve-se maior intensidade de colorac¸ão no grupo S (Synvisc®) e PR (Polireumin®), em relac¸ão ao grupo controle P (placebo-SF 0,9%); portanto, as lâminas descalcificadas e coradas com Alcian Blue pH = 1,0, Alcian Blue pH = 2,5 e Azul de Toluidina mostraram a presenc¸a de glicosaminoglicanos em maior quantidade, quando comparadas com as do grupo controle P (placebo). Isso confirma a hipótese de que os ácidos hialurônicos testados atuam como condroprotetores, pois preservaram uma maior quantidade de proteoglicanos no tecido cartilaginoso dos joelhos infiltrados com hialuronatos.
Não houve diferenc¸a estatística na comparac¸ão da intensidade de colorac¸ão das lâminas dos joelhos infiltrados com ácido hialurônico de alto peso com as de baixo peso molecular. A transposic¸ão dos dados encontrados neste estudo em coelhos podem não refletir do mesmo modo em seres humanos.
Paralelamente foi feita uma avaliac¸ão de intensidade de colorac¸ão por visão direta das lâminas, ou seja, examinador dependente. Para isso foi solicitado a um biólogo que avaliasse as lâminas conferindo-lhes notas. Esse profissional fez a classificac¸ão em notas das lâminas coradas com Alcian Blue pH = 2,5 em 1, 2 e 3 como ruim, intermediário e excelente. Obtiveram-se também resultados que confirmaram os resultados conferidos pelo aparelho, ou seja, houve diferenc¸a estatística entre os grupos tratados com hialuronatos quando comparados com o grupo placebo e não houve diferenc¸a estatística entre os grupos infiltrados com hialuronatos, independentemente do peso molecular. Os dados subjetivos foram avaliados pelo teste qui-quadrado.
A literatura que compara os diferentes pesos moleculares dos hialuronatos nesse modelo experimental é escassa. Shimizu et al.,24 em um estudo feito em coelhos, concluíram que os ácidos hialurônicos de baixo peso molecular foram superiores aos de maior peso molecular. Não se encontrou nesse estudo a dose usada nas infiltrac¸ões para melhor comparac¸ão com o presente estudo. No nosso estudo usaram-se aplicac¸ões intra-articulares por três semanas como usualmente é feito em seres humanos e o volume aplicado foi de 0,3mL das três substâncias testadas (ácido hialurônico nativo, ácido hialurônico ramificado e soro fisiológico). A meia vida do ácido hialurônico nativo é de 13 horas, enquanto a do ácido hialurônico ramificado é de 36 horas. O volume de 0,3mL foi determinado por ser essa a dose recomenda nas pequenas articulac¸ões dos seres humanos.25
Ghosh e Guidolin,26 com o uso de modelo experimental de transecc¸ão do ligamento cruzado anterior em cães, obtiveram melhores resultados com os ácidos hialurônicos de menor peso molecular. Os mesmos autores, em um estudo in vitro, encontraram melhores resultados com o uso de ácido hialurônico de maior peso molecular, o que contrariou seus estudos em animais. Seria melhor estimulador da produc¸ão de componentes da matriz celular, o que poderia ser parcialmente explicado, pois o ácido hialurônico de menor peso molecular penetraria na matriz extracelular mais facilmente, maximizaria sua concentrac¸ão e promoveria sua interac¸ão com as células alvo da sinóvia. Além disso, há evidências de que a ligac¸ão das moléculas do ácido hialurônico com os receptores celulares é dependente do peso molecular.12,13
Várias são as hipóteses do mecanismo de ac¸ão dos ácidos hialurônicos na articulac¸ão não patológica dos seres humanos. O ácido hialurônico funcionaria em uma das hipóteses como modulador, por meio da interac¸ão com receptores CD44 presentes nos sinoviócitos, atuaria bioquimicamente na articulac¸ão e diminuiria a produc¸ão de citocinas, prostaglandinas e metaloproteinases.27-30 Outros efeitos comprovados do ácido hialurônico são recuperar as propriedades fisiológicas do líquido sinovial, diminuir a pressão da forc¸a peso e melhorar a distribuic¸ão do peso exercido na articulac¸ão. Portanto, apresenta importante papel nos efeitos mecânicos articulares.31
Resumindo, neste estudo os dados encontrados confirmam os achados de Karlsson et al.,16 que estudaram os efeitos dos hialuronatos de diferentes pesos moleculares em infiltrac¸ões intra-articulares, em humanos com osteoartrose; indicam não haver diferenc¸as quanto ao peso molecular dos ácidos hialurônicos em relac¸ão à condroprotec¸ão.
Conclusão
A análise dos efeitos das substâncias ácido hialurônico nativo e ácido hialurônico de cadeia ramificada no modelo experimental de osteoartrose em coelhos demonstrou caráter condroprotetor quando comparados aos do grupo controle (SF 0,9%). Quando o ácido hialurônico de cadeia nativa e o ácido hialurônico de cadeia ramificada foram comparados entre si, não houve diferenc¸a estatística significante.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
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