Efeitos da orientação das fibras de colágeno nas propriedades mecânicas de flexão e impacto dos ossos*

Muitas investigações anteriores procuraram obter uma correlação entre a histologia do osso cortical e as propriedades mecânicas. Evans(1) verificou que os ossos com maior resistência à tração tinham como principal característica microestrutural menor quantidade de ósteons, sendo que estes eram de grande tamanho e maior quantidade de fibras de colágeno dispostas longitudinalmente na secção transversal.

Ascenzi e Bonucci(2) classificaram os ósteons em três tipos: claros, escuros e intermediários. Nos ósteons claros predomina a existência de fibras transversais ao eixo do ósteons, sendo que sob luz polarizada há a formação de luminosidade na superfície destas amostras, devido à propriedade de birrefringência das fibras de colágeno transversais. Os ósteons escuros possuem fibras de colágeno longitudinais e, sob luz polarizada, não há formação de luminosidade. Nos ósteons intermediários há a presença de fibras longitudinais em uma lame-la e fibras transversais na lamela seguinte, provocando alternância entre os campos claros e escuros nas lamelas sucessivas.

Os ósteons escuros possuem maior resistência à tração e módulo de elasticidade e menor deformação(3), enquanto que os ósteons claros possuem maior resistência à compressão(2) e os ósteons intermediários, maior resistência à flexão(4).

Em estudos realizados por Martin e Ishida(5), avaliando a correlação entre a orientação das fibras de colágeno, porosidade, mineralização e densidade com a resistência à tração, foi verificado que a orientação das fibras de colágeno foi a variável que teve maior correlação significante com a resistência à tração.

Martin e Boardman(6) abordaram as mesmas propriedades microestruturais dos ossos citadas acima, correlacionado-as com propriedades obtidas nos ensaios de flexão em três pontos. Notaram que a orientação das fibras de colágeno teve maior correlação com a resistência à flexão e segunda maior correlação com o módulo de elasticidade.

Uma outra propriedade importante que o osso exibe é conhecida como viscoelasticidade. Um material viscoelástico é aquele em que as propriedades mecânicas variam de acordo com a velocidade de aplicação da carga. Este fenômeno decorre do fato de a estrutura óssea escoar internamente de acordo com a carga aplicada. Um aumento na velocidade de aplicação da carga aumenta o módulo de elasticidade e a resistência máxima do osso cortical, enquanto ocorre decréscimo da deformação máxima(7).

O objetivo desta pesquisa foi comparar as tenacidades obtidas nos ensaios de flexão em três pontos e impacto e verificar o índice de correlação linear entre a orientação das fibras de colágeno e as propriedades mecânicas obtidas nos ensaios de flexão e impacto.

MATERIAL E MÉTODO

Os animais utilizados para a realização dos ensaios foram 20 coelhos da raça Nova Zelândia com peso entre 2 e 2,5kgf, que corresponde ao animal já na fase adulta.

Os animais foram sacrificados com injeção endovenosa do anestésico Nembutal® e os fêmures foram retirados, dissecados, hidratados em solução fisiológica e conservados em freezer a -20°C.

Ensaios de flexão
Os ensaios de flexão em três pontos foram realizados com os fêmures esquerdos dos 20 coelhos, utilizando-se a máquina universal de ensaios do Laboratório de Bioengenharia da FMRP-USP. Para obtenção da carga aplicada foi utilizada uma célula de carga de 200kgf ligada a uma ponte de extensometria. As deformações foram medidas por um relógio comparador com precisão de 0,01mm.

Os ossos foram tirados do freezer 24 horas antes do ensaio, colocados na geladeira e retirados horas antes do ensaio para que pudessem entrar em equilíbrio térmico com o ambiente. Os fêmures foram colocados em um suporte de 55mm de vão, onde a aplicação da carga foi realizada no ponto médio no sentido ântero-posterior, com uma pré-carga de 0,5kgf e tempo de acomodação do sistema de 1 minuto. Os ensaios foram realizados até a ruptura total do osso. A velocidade de aplicação de carga foi 0,30mm/minuto e as medidas realizadas a cada 0,02mm de deflexão. Com base nestes valores foi construído o gráfico carga x deflexão para os 20 fêmures ensaiados e a partir do gráfico foram calculadas as seguintes propriedades mecânicas: limites de proporcionalidade, limites máximos, rigidez, resiliência e tenacidade.

Ensaio de impacto
Os 20 fêmures direitos foram ensaiados na máquina de impacto PSd® 50/15, do Laboratório de Ensaios do Departamento de Materiais da EESC-USP, utilizando um martelo pendular tipo Charpy e um acessório de apoio com distância entre os suportes de 55mm. A técnica de descongelamento foi a mesma descrita para o ensaio de flexão e o sentido de aplicação do impacto foi o ântero-posterior.

Preparação da lâmina histológica
Após a realização dos ensaios de flexão em três pontos e impacto, secções transversais próximas ao local de fratura foram cortadas em um serra diamantada, com espessura aproximada de 1mm. Posteriormente, estas secções foram lixadas em lixa d'água até a espessura de 100µm. As peças foram colocadas em lâminas de vidro embebidas em óleo mineral, recobertas com lamínula e seladas com parafina.

Captura das imagens das secções transversais
Foi utilizado para analisar a secção óssea um microscópio Zeiss® Axiolab, utilizando uma objetiva de aumento de 2,5x e com filtros analisador e polarizador colocados no caminho de transmissão da luz (um filtro sobre a objetiva e outro sobre o condensador). Os filtros foram rodados de modo que houvesse polarização da luz transmitida, obtendo-se um campo escuro, evidenciando as fibras de colágeno transversais aos eixos dos ósteons, devido a sua propriedade de birrefringência.

As imagens das secções foram capturadas por uma câmera digital Sony® modelo SSC-DC54, acoplada ao microscópio e digitalizadas para o formato de leitura do computador (Bitmap TIFF-Tagged Image File Format), com resolução de 640x480 pixels, utilizando uma placa de aquisição de imagens Snappy® 3.0. A captura das imagens de toda a secção óssea foi feita por varreduras (de 11 a 16), já que a objetiva focaliza somente uma parte da secção (figura 1).

Medida das fibras de colágeno
Com as imagens das secções sob o efeito de luz polarizada (figura 2), foi possível identificar as fibras de colágeno e através dos processos thresholding e binarização da imagem (figura 3), a área de interesse foi selecionada. A área ocupada pelas fibras de colágeno nas secções foi medida utilizando os softwares Image Tools e Scion Image. Fazendo o preenchimento de toda a secção óssea e repetindo os procedimentos descritos anteriormente, foi calculada a área total ocupada pela secção óssea (figura 4). A área relativa ARF foi calculada dividindo-se a área ocupada pelas fibras de colágeno pela área total da secção:

Análise estatística
Foi calculada a relação entre as tenacidades obtidas nos ensaios de flexão e impacto, sendo que estas tenacidades fo-ram comparadas utilizando o teste t de Student (p < 0,05).

Os índices de correlação linear (r) entre a área relativa ocupada pelas fibras transversais e as propriedades mecânicas de flexão e impacto dos ossos foram calculados e testados utilizando o teste t de Student (p < 0,05).

RESULTADOS

A tabela 1 apresenta a média e o desvio-padrão das propriedades mecânicas obtidas nos ensaios de flexão e impacto e das áreas relativas ocupadas pelas fibras de colágeno nas secções transversais conseguidas a partir dos fêmures ensaiados.

No ensaio de impacto, quatro ossos foram eliminados do estudo, sendo dois pelo alto valor de energia absorvida (maior que três vezes o desvio-padrão) e dois por impossibilidade de obter uma secção próxima à fratura devido ao tipo ocorrido (cominutiva).

A energia absorvida (tenacidade) no ensaio de impacto foi 4,73 vezes a energia absorvida até a ruptura (tenacidade) no ensaio de flexão, sendo que houve diferença significante entre os dois valores (p < 0,001).

No teste do índice de correlação linear entre as propriedades mecânicas e a estimativa de fibras de colágeno das secções transversais (tabela 2), a rigidez e a resiliência obtidas no ensaio de flexão foram as propriedades mecânicas que tiveram índice significante (p < 0,05).

DISCUSSÃO

As propriedades mecânicas do osso variam não somente com a natureza da força aplicada, mas também com a direção e a velocidade de aplicação desta força. Materiais ideais são homogêneos e sempre se comportam da mesma maneira, independentemente da orientação, mas os ossos mostram máximas propriedades materiais em uma orientação com o mínimo peso. Eles possuem diferentes propriedades em diferentes direções, um fenômeno conhecido como anisotropia, enquanto que outros materiais são isotrópicos, isto é, independentemente da direção da carga aplicada, suas propriedades mecânicas serão sempre as mesmas(8). A resistência e a rigidez do osso são maiores na direção onde normalmente as cargas são aplicadas. Isto é particularmente verdadeiro para o osso cortical, em que ósteons são orientados na direção longitudinal devido ao tipo de carregamento que é aplicado nesta região(9).

A diminuição da deformação sofrida pelo osso compacto ocorre à medida que o número de ósteons aumenta. Isto é explicado pela fraqueza da linha de cimento, que aumenta com

o número de ósteons(10). A resistência à tração aumenta nos ósteons que têm fibras de colágeno que percorrem longitudinalmente ou envolvem espiralmente, se comparadas com ossos que têm ósteons com predominância de fibras transver-sais(1).

Os estudos mecânicos da estrutura óssea também nos fornecem mais informações para o entendimento dos mecanismos de fratura. Fratura óssea pode ser causada por trauma, degeneração, fadiga ou doença. A maioria das fraturas resulta de uma combinação de diversos fatores ocorrendo simultaneamente. Fraturas podem ocorrer quando a energia cinética de partes sob impacto é concentrada abruptamente e convertida em trabalho que produz rápida deformação no interior do osso(11).

Quando aparece uma falha no osso, a ligação mais fraca dentro dele irá quebrar. A ligação mais fraca para concentração de tensão são os canais haversianos, canalículos, lacunas e as linhas de cimento. Um osso quebra precocemente sob uma carga porque a força de tração causa grande ruptura de áreas de fácil união, produzindo deste modo mais deformação e fratura precoce do que irá causar uma força de compressão de igual magnitude(12).

O ensaio de impacto também não mostrou ser um bom ensaio dinâmico para o estudo das propriedades mecânicas, devido à grande variabilidade dos resultados e locais de fratura, dificultando, em alguns casos, a retirada da secção histológica do local mais próximo da fratura. Em outros casos, houve fratura cominutiva do osso, impossibilitando a obtenção da secção transversal para estudo histológico. Mesmo em corpos de prova de materiais isotrópicos, como os metais, e de dimensões definidas, os valores de energia absorvida podem apresentar uma variação de até 10%, aumentando para materiais anisotrópicos com variação nas dimensões, como os ossos inteiros.

Os ensaios de impacto têm como vantagem a existência de uma velocidade de aplicação de carga que mais se aproxima do carregamento rápido a que estão sujeitos os ossos longos nas colisões de automóveis e impacto sofrido por qualquer pessoa exposta a traumatismos repentinos, melhorando o entendimento do comportamento ósseo nessas situações, além de ser um ensaio de rápida realização. Mas, para que se possa compreender melhor este mecanismo é necessário reduzir ou eliminar a influência das variáveis geométricas sobre os valores de energia absorvida e aumentar a reprodutibilidade dos locais de fratura.

Os altos valores de desvio-padrão obtidos para as propriedades mecânicas devem-se ao fato de o osso, como foi estudado, constituir-se de material anisotrópico e sem uniformidade geométrica. Estas propriedades influenciam principal-mente o ensaio de impacto, provocando dispersão nos resultados. Porém, não objetivamos fazer corpos de prova, e estudar o osso como material, pelo fato de, com isso, perdermos a interação entre os diversos componentes microestruturais existentes ao longo do osso. A dispersão nos valores de energia absorvida no ensaio de impacto também foi observada por Hert et al.(13), mesmo utilizando corpos de prova retirados de ossos longos bovinos, para realização dos ensaios.

A comparação da velocidade de aplicação de carga mostra que a velocidade do ensaio de flexão (0,3mm/min) é muito menor que a de impacto (3,8m/s). Isso, provavelmente, deve explicar o alto percentual de relação entre as energias absorvidas no impacto e flexão (Eimpacto/Eflexão = 4,73), reforçando o fenômeno da viscoelasticidade do osso.

Estudos têm demonstrado a grande variabilidade das tensões nas propriedades de rigidez e energia absorvida pelos ossos, que podem ser produzidas pelo fator velocidade nos ensaios. Por exemplo, tíbias humanas podem absorver 45% mais energia quando fraturadas a taxas de deformação equivalentes ao trauma, quando comparados com ensaios em que são utilizadas baixas velocidades de aplicação de carga(14).

A maior correlação positiva obtida entre as propriedades mecânicas e a área de fibras de colágeno ocorreu para a rigidez (r = 0,43). Martin e Boardman(6), realizando ensaio de flexão em três pontos, em corpos de prova retirados de ossos bovinos, encontraram uma correlação maior entre o "índice de fibras de colágeno dispostas longitudinalmente" e a tensão máxima (r = 0,56), porém, além da diferença no tipo de osso estudado, a metodologia para o estimativa da quantidade de fibras também foi diferente, sendo que, para a deformação máxima, a correlação encontrada por Martin e Boardman(6) não foi significativa.

A resiliência apresentou a maior correlação negativa (r = - 0,46) significativa, sendo que as outras propriedades mecânicas apresentaram baixa correlação. No ensaio de impacto, a quantidade de fibras de colágeno transversais parece não afetar a energia absorvida no impacto, pois o índice de correlação (r = 0,35) não foi significante.

O próprio modelo de Ascenzi e Bonucci(2) recebe críticas pelo fato de os três tipos de ósteons conterem algumas fibras longitudinais; mesmo os ósteons com predominância de fibras transversais possuem certa quantidade de fibras longitudinais. Outro fator que provoca discussão é a teoria de que o padrão de birrefringência muda ao longo do comprimento do osso, como também a direção do eixo dos ósteons também muda. Por isso, não quisemos fazer uma divisão das amostras pelos tipos de ósteon, procurando somente estimar as fibras de colágeno dispostas transversalmente e tornar esta estimativa como uma propriedade microestrutural do osso.

Currey(15) verificou que o aumento na quantidade de ósteons eleva a porosidade do osso, diminuindo a resistência à tração. Com isso, locais com poucos ósteons de grande tamanho possuem maior densidade óssea e, conseqüentemente, maior resistência à tração, porém têm a vascularização prejudicada. Nesse trabalho, o autor já estava fornecendo indícios da relação entre a orientação das fibras de colágeno e as propriedades mecânicas, mostrando que os ossos com predominância de fibras longitudinais possuíam maior resistência à tração. Porém, estes achados seriam confirmados, mais tarde, no trabalho clássico de Ascenzi e Bonucci (2) isolando ósteons e verificando suas propriedades mecânicas.

O fato de Martin e Ishida(5) sugerirem que a porosidade e mineralização são menos importantes, ou seja, possuem me-nor correlação que a orientação das fibras de colágeno, não significa que as duas primeiras devam ser descartadas dos estudos microestruturais, visto que, se o osso for mais poroso e menos mineralizado, sua resistência mecânica tende a ser menor. Porém, são os feixes de fibras de colágeno que, de acordo com o tipo de carregamento (tração, compressão, cisalhamento ou esforços combinados), vão ter uma orientação, que, juntamente com o mineral e água, tende a maximizar a resistência do osso nesta direção para que ele possua a menor quantidade de material possível. Pode ser dito que a lei de Wolff ocorre graças ao rearranjo das fibras de colágeno, induzindo a área a sofrer formação ou reabsorção óssea, resistindo mais ao tipo de carregamento aplicado na região.

CONCLUSÕES

A tenacidade no ensaio de impacto foi maior que a do ensaio de flexão em três pontos.

No ensaio de flexão, a rigidez e a resiliência foram as propriedades mecânicas que se correlacionaram significativamente com a orientação de fibras de colágeno.

No ensaio de impacto não houve correlação significativa entre a tenacidade e a orientação das fibras de colágeno.

2. Ascenzi A., Bonucci E.: The compressive properties of single osteons. Anat Rec: 161: 377-391, 1968.

3. Ascenzi A., Bonucci E.: The tensile properties of single osteons. Anat Rec 158: 375-386, 1967.

4. Ascenzi A., Baschieri P., Benvenuti A.: The bending properties of single osteons. J Biomech 23: 763-761, 1990.

5. Martin R.B., Ishida J.: The relative effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bone strength. J Biomech 22: 419-426, 1989.

6. Martin R.B., Boardman D.L.: The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. J Biomech 26: 1047-1054, 1993.

7. Einhorn T.A.: Biomechanics of bone. In Bilezikian J.P., Raisz L.G., Rodan G.A.: Principles of bone biology, San Diego, Academic Press, 1996.

8. Turner C.H., Chandran A., Pidaparti R.M.V.: The anisotropy of osteonal bone and its ultrastructural implications. Bone 17: 85-89, 1995.

9. Hërt J., Fiala P., Petrtyl M.: Osteon orientation of diaphysis of long bones in man. Bone 15: 269-277, 1994.

10. Evans F.G., Bang S: Differences and relationships between the physical properties and the microscopic structure of human femoral, tibial, and fibular cortical bone. Am J Anat 120: 79-88, 1967.

11. Radin E. et al: Practical biomechanics for the orthopaedic surgeon. New York, John Wiley & Sons, 1979. Apud: Gould J.A.: Fisioterapia na Ortopedia e na Medicina do Esporte, São Paulo, Manole, p. 3-47, 1993.

12. Gould J.A.: Fisioterapia na Ortopedia e na Medicina do Esporte. São Paulo, Manole, p. 3-47, 1993.

13. Hërt J., Kucera P., Vavra M., Volenik V.: Comparison of the mechanical properties of both primary and Haversian bone tissue. Acta Anat 61: 412-423, 1965.

14. Burstein A.H., Frankel V.H.: A standard test for laboratory animal bone. J Biomech 21: 155-158, 1971.

15. Currey J.D.: Differences in the tensile strength of bone of different histological types. J Anat 93: 87-95, 1959.

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