a Departamento de Ortopedia, Santa Casa de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
b Serviço de Ortopedia e Traumatologia, Hospital Israelita Albert Einstein, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP,Brasil
c Instituto de Ortopedia, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
d Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP, Brasil
Introdução
Atividade física é uma das formas de retardar o desenvol-vimento das doenças crônicas não transmissíveis e novosconhecimentos sobre os efeitos agudos e crônicos do exercí-cio físico colaboraram para que um número cada vez maior deestudos comprove e relate os seus benefícios para a saúde.1Diante dessa evidência, bem como da disseminação de aca-demias de esportes e de novas possibilidades da sua prática,aumentou também a ocorrência de diferentes formas de trau-mas pela demanda exagerada de força muscular e em especialpor muitas práticas mal ou não orientadas por profissionaisda área.2,3Os traumas musculares representam alto númerode lesões no esporte profissional e recreativo e podem ocorrerpor meio de vários mecanismos e têm resultado no aumentoproporcional de estudos relacionados não somente com oprocesso de regeneração muscular, mas também em novasopções terapêuticas das diversas lesões que acometem o sis-tema musculoesquelético.4A imobilização geralmente é ométodo de escolha para o tratamento dessas lesões, emboraincorra em alterações estruturais como atrofia, proliferaçãode tecido conectivo, fibrose, perda da extensibilidade e resis-tência muscular, além de desordens metabólicas.5,6Entre asmodalidades terapêuticas são usadas as associações entreimobilização, baixa temperatura no local, compressão eelevação, ultrassom e raios laser.7,8A revascularização é fatordeterminante para a regeneração da fibra muscular apóslesão,9pois ocasiona o acesso de nutrientes e oxigenação,pelos vasos nos tecidos adjacentes, fundamental para oreparo do tecido.10Essa revascularização ocorre por meio daproliferação das células endoteliais, estimulada por fatores decrescimento como o fator de crescimento fibroblástico básico(bFGF) e fator de crescimento endotelial vascular.11A argi-nina é um aminoácido básico e precursor da síntese de umamolécula com grande importância biológica, o óxido nítrico,dentre outras.12Tradicionalmente é considerada um aminoá-cido não essencial para adultos e crianças devido à capacidadedo organismo de sintetizá-la.13Porém, em certas condiçõesde estresse ocorre o aumento do seu consumo, que excedea capacidade de sua produção endógena e torna-se assimum aminoácido condicionalmente essencial.14O óxido nítricoestá envolvido em grande variedade de funções biológicas.15Exerce função como regulador vasoativo, promove o relaxa-mento endotelial com consequente vasodilatação e assimeleva o fluxo sanguíneo aos tecidos lesados.16Desempe-nha também importante papel na resposta imunológica pormediar mecanismos de citotoxidade e defesa não específicado hospedeiro.17Atualmente as lesões musculares compõemum grupo de agravos dos mais desafiadores da traumatolo-gia esportiva, especialmente em atletas considerados de altodesempenho, pois apesar de comuns seu tratamento ainda é controverso e muitas vezes ineficiente. Habitualmente, lon-gos períodos de afastamento são necessários para que o atletaretorne plenamente a suas atividades e em alguns casos assequelas podem fazer parte do resultado final.18Diante doexposto, o presente estudo tem por objetivo avaliar a influên-cia da suplementação oral com L-arginina na regeneração delesão muscular por estiramento, induzida no músculo tibialanterior de ratos.
Material e método
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pes-quisa Experimental (Parecer 023/12), conforme protocolo dainstituição onde foi feito. Foram usados 24 ratos da linhagemWistar (Rattus norvegicus, albinus), adultos com peso médio de492,5 ± 50,45 gramas, provenientes do biotério da Universi-dade Federal do Paraná (UFPR). Foram mantidos em ambienteespecífico com temperatura (20 ± 4?C) e umidade ambientaisautomaticamente controladas, ciclos claro/escuro de 12 horase receberam ração específica (Nuvilab®, Quimitia S/A) e águaad libitum.
Delineamento do estudo
Os ratos foram submetidos à tração para estiramento passivodo músculo tibial anterior do membro posterior direito, por45 minutos, foi mantido intacto o membro posterior esquerdocomo controle. A seguir, foram separados em três grupos comoito ratos cada. O grupo não tratado (GNT) após 24 horas doperíodo de tração e sob plano anestésico foi submetido aosprocedimentos de punção cardíaca para coleta de sangue, emvolume suficiente para a indução de parada cardiorrespirató-ria e avaliações bioquímicas. Após a comprovação da morte,foram ressecados os músculos anteriores direitos e esquerdospara avaliações histopatológicas. O grupo simulação (GS) foitratado diariamente por via oral, por sete dias, com soluçãosalina isotônica. O grupo com arginina (GA) foi tratado diaria-mente por via oral, por sete dias, com solução de arginina emdoses de 3 g, diluída em solução salina isotônica. Ao sétimodia do procedimento de indução das lesões por estiramentomuscular, os ratos dos grupos GS e GA sob plano anestésicoforam submetidos aos mesmos procedimentos do GNT.
A indução anestésica foi praticada nos ratos tanto para aindução da lesão muscular por estiramento como para a coletade sangue. Para esse propósito os ratos eram previamentesedados por inalação com halotano (Tanohalo®- Cristália) emcircuito fechado, pesados em balança eletrônica (Coleman®) ea seguir anestesiados com a associação de 100 mg/kg de Ceta-mina (Ketamin®- Cristália) e 10 mg/kg de Xilasina (Calmiun®- Agner União) por via intraperitoneal, o que garante anestesiapor no mínimo quatro horas.
Indução de lesão muscular
Padronizou-se que a tração somente seria executada nosmembros posteriores direitos. Usou-se um aparelho previa-mente descrito19e especialmente elaborado para a finalidadede indução de lesão muscular por estiramento, demonstradona figura 1, no qual grupos de cinco ratos, sob indução
anestésica, eram individualmente fixados com tiras adesivas,em decúbito dorsal, com o dorso da pata do membro posteriordireito preso por fita adesiva a uma linha, a qual passava porroldana e sustentava um saco plástico pendente, com águanum volume correspondente a 150% do peso do respectivorato. Dessa forma era feita uma flexão plantar, por 45 minu-tos, que provocava uma lesão pelo estiramento do músculotibial anterior. Após a indução de lesão muscular os ratosforam transferidos para ambiente específico. Os do GNT forammantidos por 24 horas e os dos GS e GA por sete dias. Apósos períodos de manutenção e suplementações nutricionaisanteriormente descritos, procederam-se às coletas de san-gue e ressecções dos músculos tibiais anteriores de ambos osmembros posteriores para as avaliações bioquímicas séricas ehistopatológicas.
Suplementação com arginina
Usou-se 420 g de L-arginina (Merck®) diluída em quantidadesuficiente para 112 ml com solução salina isotônica, esterili-zada por filtração em membranas MF (SCWP304F0 Millipore®).Para sua administração, os ratos eram sedados por inalaçãocom halotano (Tanohalo®- Cristália) em circuito fechado eentão, por gavagem, era administrado 0,8 ml da solução quecontinha 3 g de L-arginina, uma vez ao dia, sempre no mesmohorário e durante sete dias.
Avaliações bioquímicas
Foram determinados os níveis sérios de creatina-quinase(CK-U/L), desidrogenase lática (LDH-U/L), aspartato--aminotransferase (AST-U/L) por método automatizado
enzimático fotométrico e proteína C reativa (PCR-mg/dl) porimunoensaio turbidimétrico ultrassensível.
Avaliações histológicas
O processamento histológico foi padronizado para todas asamostras de músculos tibiais anteriores e foi iniciado pelafixação dos músculos em formalina, seguida de cortes padro-nizados em planos transversais e longitudinais às fibrasmusculares e a seguir o processamento histológico automa-tizado seguido da coloração pela hematoxilina e eosina deHarris. As lâminas histológicas foram analisadas sob micros-copia óptica e descritas histopatologicamente em 50, 100 e 400aumentos, por dois patologistas independentes com ênfaseaos achados compatíveis com lesão por estiramento comoedema, hemorragia e desorganização ou alteração morfo-métrica das fibras musculares. Para evidenciar a reparaçãotecidual procuravam-se padrões histológicos com proliferaçãode tecido adiposo, angiogênese e fibras musculares. As amos-tras dos músculos tibiais anteriores esquerdos que não foramsubmetidos à tração eram consideradas como controles.
Avaliações estatísticas
Usaram-se os testes ANOVA e t de Student com valor de 0,05para definir a significância estatística entre as variáveis avali-adas.
Resultados
Avaliações bioquímicas
Nas avaliações bioquímicas, houve diferença entre osgrupos quando foram comparadas as médias das dosa-gens de creatina-quinase (p = 0,0014) e de aspartato-amino--transferase (p = 0,0150). Entre as médias das dosagensde desidrogenase lática (p = 0,3331) e proteína C reativa(p = 0,1149) não houve diferença entre os grupos (fig. 2).Observa-se no detalhe A da figura 2 que as médias dasdosagens de creatina-quinase no grupo GNT foram significa-tivamente maiores do que nos grupos GS e GA e entre essesgrupos no GA foram significativamente menores do que noGS. No detalhe C observa-se que houve diferença significativaentre os grupos GNT e GS, mas não entre os grupos GS e GA.
Avaliações histológicas
Não foram evidenciadas alterações histopatológicas em 100%das amostras dos membros posteriores esquerdos. Nasavaliações dos músculos dos membros direitos, submetidosà tração e conforme descrito na figura 3, no GNT foram evi-denciados ruptura de fibras musculares, edema e hemorragiaentre as fibras musculares, alterações morfométricas, comofibras musculares tortuosas, hipereosinofilia com perda de
estriações, o que caracterizou degeneração hialina. Nas amos-tras de músculos tracionados de ratos tratados com arginina(GA) foi evidenciada intensa angiogênese entre as fibras mus-culares, edema e fibras tortuosas.
Discussão
Os estudos experimentais contribuem para a elucidaçãodos principais aspectos do processo regenerativo musculardevido ao alto grau de similaridade morfológica dos teci-dos musculares esqueléticos entre mamíferos e possibilitamuma avaliação qualitativa dos sinais de lesão e regeneraçãomuscular.22No presente estudo, as amostras de músculostibiais anteriores dos ratos do GNT foram avaliadas precoce-mente, nas 24 horas da indução da lesão, para estabelecer opadrão histológico compatível com lesão muscular por esti-ramento, evidenciada pela ocorrência de edema e hemorragiaem todas as amostras, o que confirma a efetividade do métodoescolhido para a indução. Diferentes métodos experimentaisde indução de lesão muscular têm sido usados, por meio decontusão,23eletroestimulação,24exercícios físicos,25injeçõesde miotoxinas24e desnervação26e no presente estudo optou--se por um modelo de estiramento o qual induz alteraçõeshistopatológicas similares às observadas em humanos.19Asdoses de anestésicos usados na indução das lesões foramcalculadas para manter os animais sob indução anestésicapor quatro horas e evitar o uso de drogas anti-inflamatóriasou sedativas que pudessem interferir no processo de reparomuscular. Nos resultados histológicos deste estudo, no GNTforam confirmados os achados histológicos compatíveis comlesão por estiramento, conforme descrito nos detalhes B e Cda figura 3, na qual são evidenciados edema e hemorragiaentre as fibras musculares. A vasodilatação promovida peloóxido nítrico, após a metabolização da L-arginina, resulta noaumento da perfusão muscular e diminuição do consumode glicose pelos músculos esqueléticos, o que ocasiona adiminuição da fadiga muscular e induz a melhoria do desem-penho físico.27A dose de 3 g e a via oral de administraçãoda arginina foram indicadas em estudo em humanosque demonstrou melhoria da resistência à fadiga mediantegrandes esforços21e o aumento de força e de massa mus-cular em indivíduos sob um programa de treinamento compesos.28No presente estudo não houve intercorrências com otratamento de arginina por via oral e de acordo com a figura 2pôde-se observar diminuição significativa nos níveis séricosde creatina-quinase nos ratos tratados. Essa enzima tem sidousada como indicador do estresse imposto à musculaturaesquelética, decorrente da atividade física intensa e tambémcomo um fator de monitoramento da carga de treinamento.29No grupo GNT, a média de creatina-quinase foi de 1.375 ± 480,6U/L, significativamente maior do que as médias dos gruposGS e GA. Esse grupo, além da função de demonstrar a efeti-vidade do modelo empregado,19também evidenciou reflexos no aumento da creatina-quinase circulante. Deve ser con-siderado que as dosagens da referida enzima nesse grupoforam executadas 24 horas após a interrupção do estira-mento muscular e as dosagens nos grupos GS e GA sete diasapós. Foi verificada entre esses grupos diferença significativa(p = 0,0080), o que evidencia efeito da L-arginina na possí-vel reparação do estresse imposto ao músculo tibial anteriorpela tração provocada. Assim sendo, a arginina pode ser umpotencial tratamento para essas lesões, pois se observou, nasavaliações histológicas dos ratos tratados diariamente, porsete dias, com 3 g de arginina por via oral, a intensa angio-gênese, efeito já conhecido em treinamentos musculares compesos, que proporcionam maior resistência e ganho de massa,além de contribuir para a diminuição do percentual de gor-dura corporal.28Na avaliação da aspartato-aminotransferaseobservou-se elevação significativa dos níveis séricos nos ratosdo grupo GA (fig. 2). O aumento da concentração de proteí-nas citosólicas na circulação após o exercício reflete a lesãomuscular. As proteínas avaliadas nessas situações frequente-mente são creatina-quinase (CK), lactato desidrogenase (LDH),aspartato aminotransferase e mioglobina, que, normalmente,são incapazes de atravessar a membrana plasmática.30Os pro-cessos metabólicos relacionados com a atividade física sãomelhorados com o uso da arginina, por proporcionar melho-ria na perfusão sanguínea muscular e assim induzir maiorliberação de nutrientes, uma vez que os músculos tornam--se capazes de produzir energia por tempo mais prolongado,e de oxigênio, o que retarda a anaerobiose do processo. Tam-bém favorece a eliminação de substâncias tóxicas acumuladasdurante a prática de atividade física e torna mais fácil arecuperação muscular.
Conclusão
O uso de arginina por via oral não causou alterações meta-bólicas importantes que contraindiquem seu uso e induziuangiogênese durante a reparação de lesões musculares porestiramento.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
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