O efeito do plasma rico em plaquetas no reparo de lesões musculares em ratos

a Departamento de Ortopedia, Santa Casa de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
b Serviço de Ortopedia e Traumatologia, Hospital Israelita Albert Einstein, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP,Brasil
c Instituto de Ortopedia, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
d Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP, Brasil

Introdução

Lesões musculares são definidas como alterações, morfológi-cas ou histoquímicas, que promovem disfunção do aparelholocomotor.1Podem ser causadas por dois mecanismos: ostraumas diretos, como contusões e lacerações, e os traumasindiretos, como isquemia, denervação e estiramentos.

Cerca de 30% das lesões diagnosticadas por médicos têmrelações com o sistema muscular3e a lesão muscular é um dostraumas mais comuns ocorridos na prática esportiva, causade 10% a 55% de todas as lesões.2As lesões desportivas pare-cem ser resultado de exercícios feitos de maneira extenuanteou, ainda, inadvertida ou inapropriada. A prevalência e a inci-dência desses episódios são subestimadas devido à ausênciade notificação no universo esportivo.4Tem sido relatada inci-dência de lesões nos músculos isquiotibiais na ordem de 12%em jogadores de futebol,550,9% em atletas velocistas6e 42%em nadadores de peito.

A depender da severidade e da localização da lesão, dife-rentes manejos terapêuticos são usados, desde o tratamentoconservador e medicamentoso ao cirúrgico.8Exceto para oscasos de rupturas musculares completas, avulsões e miositeossificante, o tratamento-padrão usado para lesões muscula-res agudas é repouso, proteção, gelo, compressão e elevação;além desses princípios, não existe consenso claro sobre otratamento da lesão muscular aguda.9Portanto, ainda per-manecem questionamentos especialmente em relação aosefeitos e resultados de vários tratamentos comumente usadospara estimular o processo de reparo do músculo.

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto do sangueautólogo que vem sendo proposto desde 1990, por promoverforte estímulo ao reparo tecidual.10É obtido da centrifugaçãodo sangue periférico e a concentração de plaquetas deveidealmente ser superior a 338% da concentração do sangueperiférico.11O PRP tem propriedades curativas atribuídas aconcentrações aumentadas de fatores autólogos de cresci-mento tecidual e proteínas em nível celular. A expectativaé que esses fatores, quando introduzidos no local da lesão,aumentem o recrutamento, a proliferação e a diferenciaçãodas células envolvidas na reparação tecidual e promovam oreparo acelerado e com melhor diferenciação tecidual.

Diversos usos clínicos do PRP vêm sendo estudados,incluindo reparo de lesões condrais13e tendíneas;14reparo delesões e regeneração óssea;15tratamento de fasceíte plantar16e de úlceras crônicas em pé diabético.17O reparo das tendino-patias crônicas do tendão de Aquiles com injeção intralesionalde PRP tem mostrado resultados promissores na histologia ena morfologia do tecido neoformado.18Estudos tanto experi-mentais quanto clínicos vêm revelando os efeitos da injeçãointralesional de PRP em lesões musculares e, de modo geral, osachados desses estudos reportam melhor regeneração muscu-lar, aumento de neovascularização e redução de fibrose.

A se levar em conta a crescente incidência de lesõesmusculares e a necessidade de opções terapêuticas quepromovam regeneração muscular mais rápida e eficazmente,este estudo experimental foi feito para verificação do efeitodo PRP homólogo no reparo de lesões musculares decorren-tes de impacto induzido em ratos, a partir da avaliação dadeposição de colágeno e da análise morfológica microscópica

qualitativa do processo de reparação tecidual sete e 21 dias após tratamento.

Materiais e métodos

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética, sob o proto-colo 334/2011. O experimento foi feito no laboratório, de abril ajulho de 2012. Foram usados 35 ratos Wistar (Rattus norvegicusalbinus), machos, isogênicos, com 12 semanas de idade e pesomédio de 320 ± 20 gramas, de linhagem EPM-1, originários doBiotério Central da UFMS.

Inicialmente, ao longo de 30 dias, os animais foramsubmetidos a um período de adaptação e ganho de peso,durante o qual foram mantidos em caixas-padrão para cincoanimais, feitas de polipropileno e com tampa metálica gal-vanizada.O ambiente foi climatizado com temperatura de22 ± 3?C, iluminação artificial com ciclos claro/escuro de12 horas e umidade do ar de 56 ± 13%. Os animais eramalimentados com ração Nuvilab®CR1 (Nuvital Alimentos eProdutos Veterinários Ltda®, Curitiba, PR, Brasil) e água filtradaà vontade.

Foram formados quatro grupos de estudo de maneira ale-atória:

Grupo 1: cinco ratos submetidos à coleta de sangue para opreparo do PRP;

Grupo 2: patas esquerdas de 24 ratos cujas lesões muscularesforam tratadas com soro fisiológico (SF) 0,9%.

Grupo 3: patas direitas de 24 ratos cujas lesões muscularesforam tratadas com PRP.

Grupo 4: patas direitas e esquerdas (12 patas) de seis ratoscujas lesões musculares não foram tratadas.

Protocolo para produção da lesão experimental

Foram usados o mesmo aparelho e a mesma técnica paraprodução da lesão experimental descritos por Nogueira.26Para a feitura da lesão muscular, usou-se aparelho desen-volvido por Sene,27que consiste em duas hastes metálicastelescopadas ajustáveis, pelas quais é possível graduar aaltura de 30 cm, e uma base plástica com área de 272,5cm2. Sobre essa base, foi acoplada uma superfície metálicaretangular com área de 12,25 cm2, que serviu de apoio paraa queda do peso e fixação da pata traseira do animal emlocal demarcado, centrando o peso na região central da pata.Na parte superior final das hastes metálicas foi fixada umaestrutura metálica que proporciona estabilidade, bem comosuporta uma roldana pela qual um fio-guia fixa o peso a serliberado. Foi confeccionado, em acrílico transparente, um guia entre as hastes para conduzir o peso durante a queda livre de30 cm de altura, para evitar desvios e oscilações do peso.

O aparelho para produção da lesão por impacto foi fixado,com grampos, à mesa cirúrgica, como forma de estabilização,de modo a evitar que ocorresse qualquer oscilação na quedado peso. Para que a lesão ocorresse sempre na mesma região,a carga liberada de uma altura de 30 cm foi conduzida peloguia em acrílico e por um fio fixado diretamente sobre o pesolançado centralmente por meio de uma roldana posicionadanas hastes do equipamento.

Os animais foram previamente anestesiados com clori-drato de cetamina (60 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg) e, então,submetidos a um único trauma em cada membro, no terçomédio do ventre muscular do músculo gastrocnêmico, e sepa-rados de acordo com o grupo experimental de que fariamparte. Os 24 animais cujas patas formaram os Grupos 2 e 3sofreram lesão contusa nas patas traseiras. Na região centralposterior das patas esquerdas foi administrado 0,1 ml de SF a0,9% e, nas patas direitas, 0,1 ml de PRP.

Preparo e aplicação do plasma rico em plaquetas

Por meio de punção cardíaca feita com agulha de 0,70 × 25 mm,marca BD (22gX1"), acoplada a uma seringa descartávelde 20 ml Viet Jet®(Labor Import Comércio, Importação eExportação Ltda., Osasco, SP, Brasil) contendo 1 mL de citratode sódio a 10% (Bioclin®, Quibasa Ltda., Lote 0067/2011),foram obtidas quatro amostras contendo 8 ml de sangue comanticoagulante dos cinco ratos que compuseram o Grupo 1.O sangue anticoagulado foi imediatamente submetido àcontagem de células em aparelho automatizado SysmexXE-2100D. Realizada a primeira centrifugação foi sepa-rado o plasma do concentrado de hemáceas. Na segundacentrifugação, eliminou-se a porção sobrenadante, de formaque restasse apenas aproximadamente 1 mL do centrifugadode maior peso. Essa fração denominamos de PRP ou concen-trado de plaquetas. O PRP homogenizado e o plasma pobre emplaquetas foram submetidos a nova contagem automatizadade células, conforme demonstrado na tabela 1.

Eutanásia

Após a coleta de sangue (Grupo 1) e dos períodos de sete e21 dias após a lesão adotados para avaliação (Grupos 2, 3 e4), os animais sofreram eutanásia por meio de injeção letalcom a associação de solução injetável de cloridrato de S(+)cetamina (Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda.,Campinas, SP), tiopental sódico (Cristália Produtos Químicose Farmacêuticos Ltda., Campinas, SP) e pó estéril diluído emsolução fisiológica de cloreto de sódio a 0,9% em concentração de 100 mg/ml. Após a dissecção e coleta do músculo paraanálise, o descarte dos animais foi feito por incineração emambiente apropriado.

Formas de avaliação

O gastrocnêmio de cada animal foi retirado por meio deincisão posterior nas patas traseiras dos animais posicio-nados em decúbito ventral, com dissecção romba de pelee tecidos moles. A integridade do músculo foi preservadamantendo a origem e a inserção (fêmur-músculo-calcâneo).Fixadas com alfinetes em superfície sólida e acondicionadasem formaldeído a 10%, as peças foram enviadas para análisehistológica, ocasião em que receberam tratamento rotineirocom desidratação progressiva em álcool, inclusão em blocosde parafina, corte sagital e longitudinal de 5 m em micrótomono terço central do ventre muscular, e as lâminas foram cora-das com picrosirius red e hematoxilina eosina (HE). O examedas características histológicas e da quantidade de colágenofoi feito no Laboratório de Toxicologia e Plantas Medicinais daUniversidade Anhanguera (Uniderp).

Com o uso de microscópio óptico acoplado a computador,as imagens das lâminas foram digitalizadas e capturadas pelosistema de processamento e análise de imagens ImageLabTM.Esse sistema foi desenvolvido para análises morfométricas esubtração de imagens e pode ser usado para espécimes deescala macroscópica e microscópica. Existem vários sistemasde conversão de unidades, filtros de correção de imagens, inú-meros formatos de exportação e comunicação com outrosprogramas. O sistema apresenta, na tela do computador, aimagem original digitalizada a partir da lâmina histológicae, ao lado, três histogramas de frequência das intensida-des R (vermelho), G (verde) e B (azul) da imagem. A partirda representação desses histogramas, o sistema calcula asquantificações desejadas e todos os dados relativos a essescálculos são apresentados em planilha própria do programa,a qual pode ser convertida para planilha do Microsoft OfficeExcel 4.0.

Os principais instrumentos e procedimentos do estudo seencontram representados na figura 1.

Análise estatística

Os dados foram tabulados em planilhas do programa MicrosoftOffice Excel (2010) e a normalidade das amostras foi avaliadacom o programa Bioestat 5.0. Os cálculos para comparaçãodos dados e a elaboração dos gráficos foram feitos como programa GraphPadPrism 4.0. As medidas das variáveisnuméricas foram expressas em médias ± desvios padrão. Ascomparações intragrupos foram feitas com a aplicação doteste t de Student nas amostras de distribuição normal e doteste de Wilcoxon nas distribuições não normais. As análisesintergrupos foram feitas com análise de variância (Anova) epost hoc com o teste de Tukey nas amostras de distribuiçãonormal e com a aplicação do teste de Kruskal-Wallis e post hoccom o teste de Dunns nas amostras de distribuição não nor-mal. A normalidade dos grupos foi avaliada com a aplicaçãodo teste de Shapiro-Wilk. Adotou-se valor de p = 0,05 paradeterminação do nível de significância das diferenças encon-tradas.

Resultados

Os valores médios (e desvios padrão) da quantidade de fibrascolágenas de cada grupo em cada período de avaliação (setee 21 dias), totalizando 60 patas avaliadas, encontram-se natabela 2. Na análise intragrupos, quando comparadas as con-tagens feitas no sétimo e no 21?dia após a lesão, não houvediferença nas quantidades médias de fibras colágenas nogrupo controle (p = 0,094) nem no grupo de ratos que rece-beu SF (p = 0,817), conforme ilustra a figura 2 A e C. Por outrolado, a quantidade de colágeno observada 21 dias após a lesãofoi significativamente maior (p = 0,00021) do que aquela obser-vada sete dias após a lesão no grupo de ratos que recebeuPRP (fig. 2B). Na análise intergrupos, na contagem feita setedias após a lesão, a quantidade média de fibras colágenas semostrou significativamente menor (p = 0,014) nos ratos trata-dos com PRP em comparação com os tratados com SF, mas nãoem comparação com o grupo controle. Já na contagem feita 21dias após a lesão, não houve diferença entre os grupos comrelação à quantidade média de fibras colágenas (fig. 3).

Com relação aos achados morfológicos, aos sete diasobservou-se presença de macrófagos circunstanciais no tecidointersticial do músculo esquelético no grupo controle. Asfibras musculares nesse período se mostravam com aspectonormal. Observou-se, ainda, aparecimento de mioblastosentre as fibras musculares (fig. 4). No mesmo período desete dias, observou-se, no grupo de ratos tratados com PRP,evidente processo inflamatório por mononucleares, hemá-cias com aspecto normal e aparecimento de miotubos entreas fibras musculares (fig. 5). Já nos ratos tratados com SF,observaram-se miotubos, macrófagos e hemácias com aspectonormal (fig. 6). Aos 21 dias, as fibras musculares e os vasos san-guíneos já apresentaram aspecto normal do tecido em ratoscontrole e em ratos tratados com PRP (figs. 5 e 6). Nos ratostratados com SF, observaram-se focos de macrófagos e algumaformação de miotubos (fig. 7).

Discussão

Há evidências de que fatores de crescimento exercem papelfundamental no processo de cicatrização dos tecidos;28noentanto, além do uso isolado de muitos fatores de crescimentoainda ser impossível na prática clínica, não estão comple-tamente esclarecidos os mecanismos de ação de todos osdiferentes fatores nesse processo. A partir do conhecimentode que os grânulos-alfa das plaquetas concentram grandequantidade de fatores de crescimento específicos, como oPDGF e o TGF-beta, foi proposta técnica para a obtençãode altas concentrações de fatores de crescimento, por meio

do preparo de PRP autólogo.11Essa técnica consiste, basi-camente, no sequestro e na concentração de plaquetas doplasma sanguíneo, que resulta em produto a ser aplicado naárea da lesão em cicatrização

Apesar do uso disseminado de PRP no tratamento de lesõesmusculares de atletas e de alguns estudos terem demonstradoque o PRP pode abreviar o tempo de retorno às atividadesesportistas após a lesão,14,19,24ainda há poucos estudosexperimentais voltados para a padronização do que é o PRPe para a compreensão dos mecanismos envolvidos no uso doPRP, especificamente em lesões musculares, motivo pelo qualpoucas são as evidências passíveis de ser discutidas a partir

dos resultados deste trabalho. De toda forma, em modeloexperimental de contusão também no músculo gastrocnêmiode ratos, em cujas lesões foi injetado soro autólogo rico emplaquetas, Wright-Carpenter et al.19observaram ativaçãoacelerada de células-satélite após 30 a 48 horas da lesãoe aumento de diâmetro das miofibras em regeneração naprimeira semana após a lesão. Os autores observaram, ainda,concentrações aumentadas de FGF-2 (460%) e de TGF-beta1(82%) ao Elisa e sugeriram que poderiam, pelo menos parci-almente, ter sido responsáveis pela regeneração acelerada,devido às suas características proliferativas e quimiotáticas.

Em distensões importantes produzidas em músculo tibialanterior de ratos e tratadas com PRP ou placebo, Hammondet al.20observaram tempo de regeneração muscular significa-tivamente menor no grupo tratado com PRP e sugeriram quea aceleração da miogênese provavelmente seja o mecanismoresponsável por esse efeito do PRP, devido às concentraçõesmais altas de diferentes fatores de crescimento contidas noproduto.

Harris et al.22injetaram PRP ou SF em diferentes tecidosmusculares de coelhos sadios (sem lesões), cujas amostrasforam histologicamente avaliadas duas, seis e 12 semanasapós o procedimento. Observaram, após seis e 12 sema-nas, infiltrado inflamatório persistente, embora decrescente,nos sítios que receberam PRP, mas não nos que receberamSF. Do mesmo modo, apenas nas áreas focais de tecido decicatrização das patas que receberam PRP observaram fibro-blastos, formação de colágeno e neovascularização, o que nãofoi observado em nenhum sítio em que se aplicou SF. Os auto-res concluíram que o PRP promoveu resposta inflamatória emtecidos moles normais de coelho, assertiva que sustenta a tesedefendida neste estudo de que o PRP promove, inicialmente, aintensificação de processo inflamatório em lesões musculares.

Por outro lado, Gigante et al.23não observaram quais-quer diferenças relativas ao processo inflamatório quandoA

comparadas lesões produzidas no músculo longo de ratostratadas com PRP e não tratadas, embora, nas lesões tra-tadas, tenha se observado melhor regeneração muscular,neovascularização aumentada e leve redução de fibrose.

Deve-se ressaltar que as concentrações de diferentes fato-res de crescimento no PRP obtido de diferentes espécies (ratos,coelhos, ovelhas e humanos) apresentam variação significa-tiva, o que influencia diretamente tanto estudos experimen-tais quanto ensaios clínicos.30Daí a necessidade de protocolospadronizados para que se amplie, de fato, o conhecimentosobre os efeitos do PRP no tratamento de lesões musculares.

O uso do PRP para a regeneração de ossos e tecidos molesvem sendo foco da atenção de clínicos e pesquisadores, assimcomo vem sendo relatada a sua aplicação em diferentes espe-cialidades cirúrgicas. Desde a técnica inicialmente propostapara produção de PRP autólogo, cujo método de separaçãocelular descontínua exigia grande quantidade de sa-ngue, diversos protocolos propostos vêm contribuindopara a evolução da técnica original, incluindo necessidadede menor quantidade de sangue, uso de centrífugas debancada, baixo custo e menor tempo de produção, facilidadede aplicação em ambiente ambulatorial e menor estressesobre o sistema cardiovascular do paciente. Os protocolosaparentemente mais seguros e eficazes se referem às técnicasde dupla centrifugação adotada para a feitura do presenteestudo.

Alguns estudos demonstraram que concentrações de pla-quetas 338% maiores do que as normalmente encontradasno sangue potencializam a cicatrização de osso e de tecidosmoles em seres humanos.11Outros autores defendem a tesede que os efeitos esperados do PRP só serão alcançados quandoas concentrações de plaquetas forem oito vezes maiores doque as concentrações do sangue circulante. Neste estudoexperimental, nas quatro amostras de sangue extraído decinco ratos para a produção de PRP, obtivemos concentraçõesmédias de plaquetas cerca de quatro a cinco vezes maiores doque as concentrações observadas no sangue.

PRP assim produzido foi injetado em lesões traumáticas(contusões) produzidas no terço médio do ventre muscu-lar do gastrocnêmio das patas traseiras direitas de 24 ratos,enquanto as mesmas lesões nas patas esquerdas foram tra-tadas com SF a 0,9%. Os achados evidenciaram que, no grupode lesões tratadas com PRP, a quantidade média de colágenose mostrou significativamente menor do que a dos demaisgrupos (controle e tratamento com SF) na avaliação feita nosétimo dia após a lesão, mas que houve aumento significativo

nessa quantidade de colágeno do sétimo para o 21?dia após alesão apenas no grupo de lesões tratadas com PRP, que, nessaúltima avaliação, mostraram quantidade média de colágenosimilar à dos demais grupos.

Sabe-se que a degradação do colágeno inicia precocementee tem atividade intensa no processo inflamatório, eventoque ocorre na primeira fase da cicatrização. De fato, excetonas lesões tratadas com SF, foi observada menor quantidademédia de colágeno na avaliação feita no sétimo dia após alesão do que naquela feita no 21?dia. No entanto, na pri-meira avaliação (sete dias), a quantidade média de colágenofoi significativamente menor nas lesões tratadas com PRP doque nas lesões-controle e nas tratadas com SF. Esse achadoparece ratificar a tese segundo a qual o processo inflama-tório seja provavelmente alterado na presença de PRP, orareduzindo o período de inflamação da lesão, ora alterando aliberação de citocinas.20Os resultados, então, permitem agre-gar nova hipótese a ser testada, sugerem prolongamento oumaior intensidade da fase inflamatória e, por isso, degradaçãomais intensa do colágeno na primeira fase da cicatrizaçãomuscular Todas essas hipóteses, porém, carecem de estudosque as testem mais rigorosamente.

Por outro lado, nas fases de reparo e de remodelação,a deposição de colágeno de maneira organizada e graduadaé a característica mais importante para que haja equilíbrioentre a lise da matriz celular antiga e a síntese da nova matriz,condição imprescindível para o sucesso da regeneração dotecido muscular lesionado. Além disso, o colágeno inicial-mente produzido é mais fino do que o colágeno do tecidosaudável; esse colágeno inicial é, então, reabsorvido e umcolágeno mais espesso é produzido ao longo das linhas detensão, o qual se correlaciona positivamente com o aumentoda resistência tênsil. Neste estudo, pôde-se observar que aquantidade média de colágeno aumentou significativamentedo sétimo para o 21?dia após a injeção de PRP, o que nãoocorreu nas lesões não tratadas nem naquelas tratadas comSF. O aumento do colágeno do sétimo ao 21?dia nos ani-mais que receberam o PRP parece ter auxiliado no equilíbriodegradação-deposição de colágeno, por mecanismos que pre-cisam ser elucidados.

Nas lesões tratadas com PRP, o processo inflamatório semostrou mais evidente do que nos demais grupos do estudo naavaliação feita sete dias após o procedimento. Essa observaçãoparece ratificar que o PRP pode intensificar o processo infla-matório.

Na avaliação final com 21 dias, os achados morfológicosdas lesões-controle e das lesões tratadas com PRP foram seme-lhantes, o que indica boa regeneração do músculo lesionadoem ambos os grupos. A administração de PRP parece não terdemonstrado diferenças nos aspectos morfológicos com 21dias, no fim do processo de reparo da lesão muscular, quandocomparada com o grupo controle, já que as mesmas caracte-rísticas foram observadas nas lesões não tratadas. Por outrolado, nas lesões tratadas com SF, o tecido ainda não mostravaplena regeneração, com fibras musculares ainda em formaçãoe com ausência de vascularização.

Esta análise descritiva morfológica corrobora os achadosquantitativos da deposição de fibras colágenas nas cicatrizesmusculares, pois mostra que no grupo em que fora apli-cado soro fisiológico apenas,ainda em 21 dias havia reaçãoinflamatória, enquanto nos outros dois grupos o tecido jáhavia se recomposto totalmente, o que sugere, talvez, melhororganização do processo de reparo muscular no grupo em quefora usado o PRP.

Neste estudo, a contribuição se limita à observação de queo PRP ativou significativamente o processo inflamatório setedias após ser injetado em lesões contusas produzidas no mús-culo gastrocnêmio de ratos, razão pela qual parece ter havidomaior degradação de colágeno nesse período. Por outro lado,resultou em aumento significativo de colágeno entre o sétimoe o 21?dia após o procedimento, o que sugere uma completarestituição tecidual.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

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