As lesões ósseas primárias compreendem um pequeno grupo, porém com uma variedade de subtipos histológicos. A identificação desses subtipos permitiu extensa classificação dos tumores ósseos, demonstrando heterogeneidade e dificuldade de diagnóstico(21). Os tumores cartilaginosos são os que mais se enquadram nessa situação, pois lesões cartilaginosas aparentemente benignas comportam-se, algumas vezes, de forma agressiva ou até mesmo maligna, enquanto tumores com aparência maligna podem demonstrar progressão limitada. As características citológicas podem estar presentes somente em uma região microscópica do tumor, podendo resultar em diagnóstico errôneo(4).
Atualmente, com o avanço das pesquisas em câncer, as técnicas citogenéticas e moleculares têm possibilitado a identificação de rearranjos cromossômicos complexos, permitindo, assim, o diagnóstico de neoplasias pela implicação de genes específicos e eventualmente a elucidação de mecanismos básicos da tumorigênese(51,62). Conseqüentemente, a análise de alterações genéticas em tumores primários pode contribuir para o diagnóstico e o prognóstico mais preciso e identificar os que apresentam potencial metastático e que necessitam de terapias mais agressivas.
As células neoplásicas podem apresentar mutações que resultam em instabilidade genética e, a partir de então, desencadeiam o processo de transformação celular. As alterações cromossômicas oriundas desse processo podem ser agrupadas em três categorias amplas, de acordo com o mecanismo pelo qual promovem crescimento maligno: a relocação de seqüências gênicas, sem ganho ou perda de material (translocações, inversões e inserções), que afetam genes próximos aos pontos de quebras e podem resultar na desregulação de genes celulares normais ou na formação de genes oncogênicos quiméricos; a perda ou ganho de material genético (deficiências parciais e totais); e as amplificações (duplicação, trissomia, isocromossomo, double minutes e regiões homogeneamente coradas), que causam muitas vezes alterações na dosagem de blocos grandes de genes, tornando difícil a identificação das seqüências de DNA responsáveis pela indução de alterações fenotípicas(40).
Os genes envolvidos no desenvolvimento do câncer segundo seu papel no processo tumorigênico são classificados como oncogenes, genes supressores e genes de reparo do DNA. Os oncogenes existem normalmente em todas as espécies de eucariotos investigadas e estão envolvidos nos sinais bioquímicos inter e intracelulares e no controle da proliferação celular. De acordo com a natureza e localização intracelular, as proteínas codificadas são classificadas em várias categorias, como proteínas quinases (com função de fosforilação de resíduos de tirosina ou treonina/serina), receptores de fatores de crescimento (geralmente uma proteína quinase), proteína G (com capacidade de ligação a GTP e hidrólise), proteínas nucleares (fatores de transcrição) e fatores de crescimento(40).
Em contraste com as mutações que ativam oncogenes, mutações que levam à perda de função de genes supressores também contribuem para o desenvolvimento tumoral. Os genes supressores podem ser definidos como genes cuja perda ou inativação permite que uma célula manifeste um fenótipo de proliferação neoplásica, contribuindo, dessa forma, com os oncogenes no controle da proliferação e diferenciação celular. Mutações nos genes supressores seguem um padrão recessivo de herança mendeliana, enquanto os oncogenes apresentam um padrão dominante(20).
Estudos recentes têm demonstrado um papel fundamental de mutações envolvendo uma terceira classe de genes na progressão do câncer, os genes de reparo do DNA. A inativação dos genes de reparo não afeta diretamente o controle do crescimento celular normal; todavia, parece que sua inativação resulta em taxa aumentada de mutações em uma variedade de genes celulares, incluindo oncogenes e genes supressores de tumor(17,62).
ALTERAÇÕES GENÉTICAS NOS TUMORES ÓSSEOS
A base genética dos tumores ósseos é muito similar à observada em outros tumores do organismo humano. Em todos os casos, o descontrole da proliferação celular como conseqüência da ativação de oncogenes ou a inativação de genes supressores de tumor representa um papel crucial no processo de transformação maligna(8,62).
Um grande número de regiões cromossômicas envolvidas em aberrações primárias de diferentes tipos de tumores coincide com a localização de oncogenes, sugerindo que tal associação não é casual(44). Os fenômenos que ativam os oncogenes, como as mutações gênicas e os rearranjos cromossômicos estruturais (principalmente as translocações e as duplicações), são responsáveis por alterações moleculares que dão início à transformação celular. Assim, um dos grandes desafios dos estudos citogenéticos é distinguir, no grande arsenal de aberrações cromossômicas que ocorrem durante a progressão tumoral, aquelas que são realmente relevantes. Os resultados obtidos servem como ponto de partida para investigações em nível molecular, auxiliando na localização de oncogenes e genes supressores de tumor que possam desempenhar função importante no processo multipasso da carcinogênese.
Em alguns tipos de tumores ósseos são encontradas alterações cromossômicas características envolvendo genes distintos. Principalmente em sarcomas, as translocações descritas (específicas de tecidos músculo-esqueléticos) formam proteínas quiméricas resultantes da justaposição de dois genes alterados (quadro 1). Essas proteínas participam na tumorigênese como um ativador transcricional anômalo.
Em cerca de 85% dos sarcomas de Ewing, que ocorrem na forma esquelética e extra-esquelética, tem sido observada uma translocação que envolve os braços longos dos cromossomos 11 e 22, t(11;22)(q24;q12) e 5 a 10% desses tumores apresentam translocações variantes, como t(21;22)(q22;q12) e t(7;22)(p22;q12)(8,27-29,51). Tais translocações promovem a fusão da região 5' do gene EWS (22q12) com a região 3' de um dos outros genes, localizados nos pontos de quebras envolvidos em cada tipo de translocação, como FLI1 (11q24) (figura 1), ERG (21q22) e ETV1 (7p22). O processo de fusão gênica leva à formação de proteínas quiméricas com domínios de ligação ao DNA que atuam com fatores transcricionais(29).
Nos sarcomas sinoviais, a presença da translocação t(X;18) (p112;q11) em 90% dos casos sugere um papel central no desenvolvimento desses tumores(33). Essa translocação envolve o gene do sarcoma sinovial (SYT) no cromossomo 18 e dois genes intimamente ligados e relacionados, SSX1 e SSX2 no cromossomo X(9). A função do gene quimérico ainda não é conhecida; entretanto, vários domínios SH3 e SH2 foram identificados na proteína syt e podem ser importantes em seu papel como proteína sinalizadora intracelular(13,30,51).
Os lipossarcomas mixóides, tumores de partes moles, ca-racterizam-se em 90% dos casos pela presença da translocação t(12;16)(q13;p11), com a fusão do gene FUS mapeado no cromossomo 16, de função desconhecida com o gene CHOP em 12q13, que regula negativamente a diferenciação de adipócitos(12,52). Há indicações de que a fusão gênica FUS/ CHOP pode regular genes envolvidos na tumorigênese de lipossarcomas(8). Dentre os subtipos de lipossarcomas, pleomórficos e bem diferenciados, não tem sido observado um marcador citogenético. Contudo, têm-se observado rearranjos múltiplos e translocações no primeiro tipo e cromossomos em anel r(12) e marcadores gigantes, com amplificação das regiões 12q14-15 e 12q21-22, no segundo tipo(49).
Em rabdomiossarcomas os dois tipos mais comuns são os alveolares e embrionários(8). O embrionário ainda não apresenta uma alteração genética característica; entretanto, a maioria dos alveolares apresenta a translocação t(2;13)(q35; q14) e, em 10-20% dos casos a translocação variante t(1;13) (p36;q14), que sugere uma relação dessas alterações genéticas com o desenvolvimento desse tipo tumoral(59). As translocações resultam na fusão do gene FKHR (forkhead - desenvolvimento do sistema nervoso), em 13q14 ao gene PAX3 ou PAX7 (paired-box homeo - regiões conservadas em genes homeóticos e relacionadas com o desenvolvimento hu-mano) em 2q35 e 1p36, respectivamente. O gene PAX3 apresenta grande interesse, pois codifica um fator de transcrição que ativa genes alvos específicos importantes no desenvolvimento do sistema nervoso humano e principalmente durante a diferenciação das células da musculatura esquelética(8,13,14,62). Similarmente, FKHR tem sido relacionado com o controle do desenvolvimento embrionário e expressão gênica específica em determinados tecidos em adultos(22). Portanto, o papel desempenhado por esses genes pode ser relevante no desenvolvimento e freqüência de rabdomiossarcoma, principalmente em crianças.
Em condrossarcomas mixóides extra-esqueléticos obser-va-se a translocação recorrente, t(9;22)(q22;q12)(57), que envolve o gene EWS e um novo gene denominado TEC (translocado em condrossarcoma mixóide extra-esquelético)(19). O gene TEC parece ser um membro da subfamília de receptores nucleares, provavelmente atuando no controle da diferenciação e proliferação celular. A fusão ews/tec é o segundo exemplo de conversão oncogênica de um receptor nuclear no processo de tumorigênese humana(8).
Os estudos citogenéticos em osteossarcomas são limitados devido a pobre adaptação de suas células tumorais in vitro e crescimento consistente de fibroblastos normais. O desenvolvimento de osteossarcoma não tem sido relacionado com alterações genéticas características; todavia, múltiplas anormalidades estruturais e numéricas complexas são relatadas(5,35). Há envolvimento preferencial do cromossomo 13, especificamente do gene RB1 e do cromossomo 17, principalmente deficiências, com implicação direta do gene su-pressor de tumor TP53. Em cerca de 30% dos casos de osteossarcomas também tem sido observada amplificação do gene MDM2, mapeado em 12q13-14. Há indicações do envolvimento de outras regiões como 1p11-13, 11p15 e 12p13, em que estão localizados três membros da família RAS, o NRAS, o HRAS e o KRAS, respectivamente(6). Contudo, as inúmeras alterações citogenéticas observadas em osteossarcomas têm dificultado a evidenciação de regiões específicas envolvidas no desenvolvimento desses tumores.
Nos últimos anos, as investigações citogenéticas em tu-mores ósseos benignos têm mostrado que a ocorrência de alterações cromossômicas não é exclusiva das lesões malignas. Entre os tumores mesenquimais, incluindo ósseos e condromatosos, as regiões 12q13-15, 6p21-q23 e 13q12-q22 são as mais freqüentemente envolvidas. Molecularmente, os genes alvos localizados em 12q e 6p parecem ser membros da família de um grupo de proteínas de alta mobilidade (hmg), hmgic e hmgi(y), respectivamente. Em tumores benignos, o gene HMGIC está alterado em lipomas, leiomiossarcomas uterinos, tumores de glândulas salivares, hamartomas condróides pulmonares(31,54) e tumores condromatosos. Em tumores malignos, foram observadas alterações em fibrossarcomas, lipossarcomas, leiomiossarcomas e histiocitoma fibroso maligno(54).
ALTERAÇÕES DO CICLO CELULAR EM TUMORES ÓSSEOS
Além dos genes quiméricos, estudos moleculares têm demonstrado que outro mecanismo freqüentemente responsável pela tumorigênese em sarcomas ósseos é a perda de função de genes supressores de tumor, principalmente os genes RB1 e TP53(8,25,30). Em vários tumores ósseos, também temse observado a amplificação da região 12q13-14, incluindo os oncogenes CHOP, SAS, MDM2, CDK4 e GLI(33,41).
O gene RB1 foi o supressor de tumor protótipo da hipótese dos dois passos mutacionais formulada por Knudson(36) no desenvolvimento do retinoblastoma. Ele foi mapeado em 13q14 e codifica uma fosfoproteína nuclear, p110 ou pRb, com papel fundamental na regulação do ciclo celular(24).
A proteína pRb inibe a proliferação celular, reprimindo um conjunto de genes que são controlados por fatores de transcrição (família E2F), com papel de transativação de genes cujos produtos são importantes na progressão da fase G1 para S do ciclo celular (figura 2). Em G1 a proteína pRb na forma hipofosforilada permanece ligada ao complexo E2F até sua fosforilação, convertendo-o em repressor de genes alvos e impedindo a progressão do ciclo celular. A fosforilação da pRb pelo complexo cdk/c libera E2F e permite que ative a transcrição de genes necessários para a transição G1-(60). A pRb é mantida no estado hiperfosforilado para a progressão do ciclo celular e não é desfosforilada até que a célula complete a mitose e entre novamente na fase G0 ou G1(55). Mutações no gene RB1 levando à inativação da proteína pRb podem interferir diretamente no controle do ciclo celular, assim promovendo um aumento da proliferação celular e, conseqüentemente, no processo de tumorigênese.
O gene TP53 foi o segundo a ser relacionado com o desenvolvimento de osteossarcomas, sendo a freqüência de mutações alta (20 a 60%)(43,46,58). As evidências de tal associação foram decorrentes de estudos em famílias apresentando a síndrome de Li-Fraumeni, cujos pacientes com mutações no gene TP53 na linhagem germinativa exibiam alto risco de neoplasias de mama, cérebro, córtex adrenal, osso, tecidos moles e sangue(34,42,63).
O gene TP53 está localizado no braço curto do cromossomo 17, na região 17p13.1 do genoma humano(26). O produto gênico consiste numa fosfoproteína nuclear com função de ativação transcricional(8,25). A proteína p53 regula negativamente a proliferação celular e funciona como um gene su-pressor de tumor, pois está envolvida no controle da progressão do ciclo celular e na preservação da estabilidade genética. Em decorrência do acúmulo de lesões no DNA e perturbações na regulação do ciclo celular, ocorre aumento da proteína p53, induzindo a ativação de genes envolvidos no controle negativo da proliferação celular e de genes do reparo do DNA. A parada em G1 do ciclo celular é, portanto, de-pendente de p53, através da transativação da p21, inibindo a atividade das quinases dependentes de ciclinas (cdk/c) na fase G1, mantendo o complexo pRb-E2F hipofosforilado e, conseqüentemente, inibindo a entrada na fase S(55).
A produção aumentada de p53 tem três funções importantes: atuar na supressão da proliferação celular, na indução da morte celular programada ou apoptose e na indução de diferenciação celular. Portanto, ela funciona como uma espécie de guardiã molecular da integridade genômica, bloqueando
o ciclo celular na fase G1 e permitindo o reparo de DNA. Caso contrário, se a lesão não é reparada, a p53 inicia o processo de apoptose celular e, nas células em que sua função foi perdida, instala-se um estado de instabilidade genética podendo levar a amplificações gênicas, aneuploidias e outras aberrações cromossômicas responsáveis pela progressão do câncer(23).
Em neoplasias ósseas outro gene que está amplificado em uma variedade de sarcomas humanos é o oncogene celular MDM2 (mouse double minute 2), localizado por Oliner et (47) na espécie humana no cromossomo 12, na região 12q13-14. A proteína mdm2 é capaz de ligar-se à p53 através de seu domínio de ativação transcricional, bloqueando sua função de regulação no processo de progressão do ciclo celular e impedindo seu efeito antiproliferativo(7,45). Ela inativa a função de transcrição de p53; portanto, a expressão aumentada do gene MDM2, em sarcomas, inativa a transcrição da p53 normal e permite o crescimento de células tumorais expressando níveis elevados da p53 normal(18). Amplificação de MDM2 pode, portanto, ser um processo alternativo para a inativação da p53 no processo tumorigênico.
Alterações nos genes RB1, TP53 e MDM2 têm sido relacionadas com o desenvolvimento de osteossarcomas e outros sarcomas. A associação entre perda de função de RB1 e osteossarcoma foi reconhecida através de estudos em pacientes que apresentavam mutações nesse gene na linhagem germinativa e predisposição ao desenvolvimento de retinoblastoma e de diversos tipos de tumores secundários, entre eles o osteossarcoma(16).
As deleções em RB1 têm sido evidenciadas em outros ti-pos de lesões ósseas, como histiocitoma fibroso maligno, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor de células gigantes maligno, lipossarcoma, sarcoma sinovial, neuroepitelioma periférico, leiomiossarcoma, hemangiopericitoma e formas extra-esqueléticas de condrossarcoma(8,43).
A importância das mutações no gene TP53 no processo de desenvolvimento de tumores ósseos e sarcomas de tecidos moles tem sido confirmada pela ocorrência de mutações em ponto e alterações genéticas afetando regiões específicas do gene (exons 5, 6, 7, 8 e 9)(2,8,10). Em osteossarcomas, a maioria dessas mutações consiste em transição do nucleotídeo citosina para timina (CT) nos exons 7 e 8(43); em outros sarcomas ósseos, entre eles histiocitoma fibroso maligno, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma, lipossarcoma, fibrossarcoma, sarcoma sinovial e sarcomas não diferenciados, têmse observado 78% de transversões e 22% de transições no exon 5(62).
A expressão aumentada da proteína p53 foi demonstrada pioneiramente em lesões benignas e não-tumorais de tecidos moles intimamente relacionados com o tecido ósseo, tais como encondroma, condromatose sinovial(11), lipomas pleomórficos, quelóides, miositis, fascitis e fibroma desmóide. O aumento de p53 nesses tipos de lesões pode ser devido a mecanismos fisiológicos específicos do tipo celular ou conseqüência de um evento mutacional(15).
A amplificação de MDM2 tem sido observada principal-mente em lipossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, osteossarcoma, rabdomiossarcoma(10,32,37,41,43,48) e sarcoma de (38,43). A ocorrência de níveis elevados das proteínas p53 e mdm2 foi relatada em vários tumores, incluindo sarcomas de partes moles e ósseos(10,41), carcinomas de bexiga, tu-mores testiculares e linfomas não-Hodgkin(38).
IMPLICAÇÕES CLÍNICAS
A identificação de marcadores cromossômicos e moleculares específicos aos tumores é ferramenta importante para o diagnóstico preciso das neoplasias, inclusive das lesões ósseas. As técnicas citogenéticas e moleculares permitem dissecção submolecular dessas neoplasias, que pode ajudar na identificação dos mecanismos importantes na tumorigênese.
Histopatologicamente, sarcoma de Ewing, linfoma nãoHodgkin, neuroblastoma, rabdomiossarcoma embrionário e hemangiopericitoma podem ser tão similares, que têm sido referidos na literatura de forma coletiva como tumores de células azuis. Contudo, anormalidades cromossômicas específicas para os diferentes tipos de tumores e a clonagem de fusão de genes decorrentes de várias translocações têm permitido diagnóstico diferencial mais eficiente(8).
Cisto aneurismático, tumor de células gigantes e osteossarcoma telangiectásico podem apresentar dilemas radiológicos que também não são resolvidos por meio de investigações histológicas. A análise citogenética, entretanto, tem identificado anormalidades cromossômicas múltiplas e complexas em osteossarcoma(3,5), associações teloméricas em tumores de células gigantes(6) e cariótipo normal em cisto ósseo aneurismático(5). As alterações genéticas observadas podem representar papel fundamental no diagnóstico dessas patologias. De forma semelhante, osteossarcoma parosteal pode algumas vezes comportar-se histologicamente como lesão benigna do tipo osteocondroma. Enquanto a avaliação histológica pode não ser precisa, as alterações citogenéticas encontradas, como cromossomos em anel nos osteossarcomas, podem ser importantes no diagnóstico diferencial dessas patologias.
O significado das anomalias cromossômicas em tumores benignos permanece pouco esclarecido. Aberrações específicas têm sido descritas em várias lesões benignas e podem ser úteis na diferenciação de seus correspondentes malignos. Por exemplo, a distinção entre lipoma e lipoma atípico ou lipossarcoma bem diferenciado pode ser possível devido à presença de cromossomos em anel nos dois últimos. Alguns lipomas são classificados por alguns autores como atípicos e localmente agressivos, porém benignos, enquanto outros os classificam como lipossarcomas bem diferenciados com to-dos os riscos de recorrência e diferenciação. Cromossomos em anel são observados em ambos os casos, assim evidenciando associação biológica comum entre as duas entidades(13).
Em algumas lesões ósseas benignas, como osteocondromas, fibromas condromixóides, encondromas e lesões malignas como condrossarcomas, parece haver uma região (6q13-21) freqüentemente envolvida em alterações cromossômicas. Esse marcador citogenético provavelmente está associado com comportamento local agressivo nesses tumores cartilaginosos(53). Similarmente, a região 8q24 tem sido relacionada com o desenvolvimento de exostose múltipla here-ditária(39). Estudos moleculares têm indicado três regiões cromossômicas envolvidas com o desenvolvimento de exostose múltipla, a EXT1 em 8q24, a EXT2 na região pericentromérica do cromossomo 11 e a EXT3 em 19p11-13. Nesses casos, a perda de heterozigosidade é observada nos genes EXT1 e EXT2 em condrossarcomas derivados de exostose múltipla e esporádicos, sugerindo que esses genes podem apresentar funções como supressores de tumor(1).
Alterações moleculares nos oncogenes MYC, RAS, FOS e genes supressores RB1 e TP53 têm sido estudadas em tu-mores ósseos primários, recorrentes e metastáticos. Enquanto em condrossarcoma não têm sido observadas mutações nesses oncogenes(50,61), em osteossarcomas e tumores ósseos de células gigantes há descrição de alterações nos genes TP53 e RB1. A ocorrência de mutações em TP53 tem sido relacionada com a agressividade tumoral em uma variedade de osteossarcomas. Em tumores de células gigantes, também têm sido freqüentemente relatadas alterações no oncogene MYC e menos comumente no gene FOS, evidenciando que lesões benignas também apresentam alterações em oncogenes(50).
O progresso nos estudos citogenéticos e moleculares em tumores ósseos benignos e malignos é evidente; porém, principalmente nos benignos, ainda há muito a ser esclarecido para que se possa estabelecer uma correlação mais precisa entre alterações moleculares, diagnóstico e prognóstico. Todavia, as técnicas moleculares estão disponíveis para auxiliar na identificação de genes específicos, na compreensão dos eventos genéticos envolvidos na etiologia do processo tumoral, no desenvolvimento de novas técnicas para o diagnóstico diferencial, assim como no prognóstico e tratamentos mais efetivos com perspectivas para terapia gênica.
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