a Departamento de Ortopedia, Santa Casa de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
b Serviço de Ortopedia e Traumatologia, Hospital Israelita Albert Einstein, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP,Brasil
c Instituto de Ortopedia, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
d Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), São Paulo, SP, Brasil
Introdução
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos anucleados pre-sentes no sangue e produzidos a partir de megacariócitos namedula óssea.1,2Do total das plaquetas presentes no orga-nismo, 70% estão presentes na circulação e 30% no baço,permanecem na circulação durante uma média de dez dias,quando são retiradas pelas células reticuloendoteliais do baçoe do fígado.1-3As plaquetas estão diretamente envolvidas emdiversas patologias importantes, sejam em síndromes ou qua-dros trombóticos graves como a trombose arterial.
O sistema hemostático é intrinsecamente responsável pelamanutenção do fluxo sanguíneo e da integridade vascular,visto que é capaz de formar um tampão sobre uma superfíciedanificada do endotélio vascular quando esse sofre uma injú-ria. Dessa forma, a hemostasia minimiza a perda sanguínea epromove a restauração da arquitetura vascular normal.
O plasma rico em plaquetas (PRP) é a concentração autó-loga de plaquetas em pequeno volume de plasma, obtido porcentrifugação do sangue total, considerada importante fontefatores de crescimento. Sua constituição básica se dá por trêscomponentes: plasma, leucócitos e plaquetas. A fibrina ricaem plaquetas (PRF) é um concentrado de plaquetas, obtido deuma membrana de fibrina, com alto potencial de regeneraçãotecidual. Assim como no PRP, os concentrados de plaquetascontidos na PRF liberam fatores de crescimento (FC) que apri-moram o processo de regeneração. Além disso, a matriz defibrina promove angiogênese, facilita o acesso ao local lesio-nado, com importante papel na cicatrização tecidual.
Descrita pela primeira vez na França em 20009a plaquetarica em fibrina (PRF), conceito novo e ainda pouco descrito naterapêutica com o uso de gel de fibrina, é um concentradode plaquetas sobre uma membrana de fibrina com um altís-simo potencial de reparação de feridas. A membrana é obtidaa partir de sangue autólogo sem adição de fatores externos.
Sabe-se que as plaquetas atuam no processo de hemos-tasia, na cicatrização de feridas e na reepitelização, liberamdiversos fatores de crescimento e que pelo menos sete diferen-tes FC foram identificados na fase inicial da cicatrização. Porisso, a liberação desses FC pelos grânulos- das plaquetas temum aspecto importante no controle e na proliferação de célu-las mesenquimais, incluindo os fibroblastos. O PRP é ativadopela adição de íons de cálcio, com liberação de FC e a exocitosedos grânulos- , e transforma o fibrinogênio em fibrina. Pormeio desse processo, obtém-se, também, cola de fibrina autó-loga, denominada também de gel de plaquetas ou gel de PRP.A apresentação do PRP em forma de gel facilita sua aplicaçãoe seu manuseio em diversas áreas cirúrgicas e favorece aintegração de retalhos e enxertos, sejam ósseos, cutâneos,cartilaginosos ou de células de gordura. O uso resulta emcicatrização mais rápida e eficiente, pelo efeito de aderênciado gel, que é proporcional ao fibrinogênio presente.
A obtenção do PRP e da PRF é relativamente simples ede baixo custo. Esses concentrados plaquetários proporci-onam tratamentos autólogos com potencial para estimular o processo biológico natural da cicatrização e auxiliarna regeneração de diversos tecidos. A diferença básica naobtenção do PRP e do PRF é que para se obter plasma rico emplaquetas é usado tubo com anticoagulante (citrato de sódio3,2% ou EDTA), enquanto que para se obter plaqueta rica emfibrina o sangue deve ser coletado em tubo seco.
Existem vários sistemas de preparo de PRP disponíveis, pormeio de centrífugas de bancada, mas em estudos pré-clínicose clínicos os resultados apresentados parecem contraditórios.Há uma lacuna de estudos mais sistemáticos e consisten-tes sobre o assunto, o que faz com que o preparo do PRPpermaneça, ainda, um procedimento experimental, apesar desua promissora aplicação na regeneração tecidual.
Calixto,14ao estudar o sangue de humanos, pôde verificarque o melhor método de obtenção de PRP é aquele no qualé feita uma única centrifugação, de 200 g por 10 minutos. JáPereira,15com sete protocolos para a obtenção de PRP em equi-nos, pôde verificar que quanto maior a força g e maior o tempode centrifugação, maior é a concentração plaquetária total.
Uma vez que os animais usados em grande escala, emlaboratórios de pesquisa, são os ratos e devido à escassez deestudos nesse modelo animal, optamos por fazer este trabalhopara avaliar qual o melhor método para a obtenção da melhorconcentração de plaquetas, em diferentes protocolos, quan-tificar a concentração de plaquetas do sangue de ratos SHR,por meio de diferentes protocolos de centrifugação, e avaliarqual o método mais eficaz de obtenção de concentrado deplaquetas.
Materiais e métodos
O trabalho foi feito no laboratório de Microcirurgia da Disci-plina de Cirurgia da Mão e Membro Superior do Departamentode Ortopedia e Traumatologia e no laboratório de Hemato-logia do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicasde nossa instituição. Foi aprovado pelo Comitê de Ética emPesquisa (CEP n?0312/12).
Usamos 40 ratos machos da linhagem isogênica SHR, entre280-300 g, fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento deModelos Experimentais para Medicina e Biologia. Os animaisforam mantidos em gaiolas coletivas com cinco ratos em cada,em biotério com condições controladas com ciclo claro/escuro(12/12 h), temperatura de 21 ± 2?C, livre acesso à água e raçãopor todo o período do experimento.
Os animais foram divididos em três grupos:
Grupo Controle (GCT) - sangue total sem centrifugação (n =5).
Grupo Única Centrifugação (GUC) - sangue total submetidoa uma única centrifugação. Esse grupo foi dividido em doissubgrupos:
GUC - I: centrifugação a 200 g por 10 minutos (n = 5)
GUC - II: centrifugação a 400 g por 10 minutos (n = 5)
Grupo Dupla Centrifugação (GDC) - sangue total subme-tido a uma centrifugação, seguido de coleta do plasma total e
realizado uma segunda centrifugação, em diferentes rotações.Esse grupo foi dividido em cinco subgrupos:
GDC-I: centrifugação a 200 g por 10 minutos, seguida desegunda centrifugação de 200 g por 10 minutos (n = 5)
GDC-II: centrifugação a 200 g por 10 minutos, seguida desegunda centrifugação de 400 g por 10 minutos (n = 5)
GDC-III: centrifugação a 200 g por 10 minutos, seguida desegunda centrifugação de 800 g por 10 minutos (n = 5)
GDC-IV: centrifugação a 400 g por 10 minutos, seguida desegunda centrifugação de 400 g por 10 minutos (n = 5)
GDC-V: centrifugação a 400 g por 10 minutos, seguida desegunda centrifugação de 800 g por 10 minutos (n = 5)
Obtenção das amostras de plasma e sangue
Os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal,com solução anestésica composta por xilasina 1U/100 g e keta-mina 1U/100 g.
Após serem anestesiados, foram retirados 3 ml de sanguede cada animal através de punção cardíaca. O sangue foi acon-dicionado em tubo de coleta vacutainer com citrato de sódio3,2%.
O sangue dos animais do grupo controle não foi submetidoà centrifugação e foi analisado após agitação do tubo por doisminutos a 4?C, para homogeneização.
As amostras de sangue total dos animais foram centrifu-gadas de acordo com o protocolo para cada grupo descritoacima, em centrífuga de bancada (Eppendorf 5810 R) a4?C.
Após a centrifugação do sangue dos animais, submetido auma única centrifugação, o plasma total foi coletado em tubotipo eppendorf de 1,5 ml e submetido à contagem de plaquetasno terço inferior da amostra.
Para o sangue dos animais, submetido a duascentrifugações, após a primeira centrifugação o plasmatotal foi coletado em tubo tipo eppendorf de 1,5 ml e subme-tido a nova centrifugação. A contagem de plaquetas foi feitano terço inferior da amostra (fig. 1).
Contagem de plaquetas
As amostras obtidas foram submetidas à contagem de plaque-tas, por meio de um analisador hematológico (Animal BloodCounter - ABC Vet) devidamente calibrado para os parâmetrossanguíneos de ratos (fig. 2).
Métodos estatísticos
Os parâmetros hematológicos resultantes segundo os sub-grupos com uso de medidas resumo (média, desvio padrão,mediana, mínimo e máximo) foram comparados com ossubgrupos com uso de testes Kruskal-Wallis seguidos decomparações múltiplas não paramétricas de Dunn quandonecessárias para comparar os subgrupos dois a dois.
Resultados
Os resultados foram ilustrados com uso de tabelas e de gráfi-cos de barras que representam os valores medianos de cadaparâmetro segundo subgrupos e os testes foram feitos comnível de significância de 5%.
A tabela 1 mostra que todos os parâmetros avaliados apre-sentaram diferença estatisticamente significativa entre osgrupos (p < 0,05).
As figuras 3 e 4 sugerem maiores valores de leucócitos eeritrócitos no grupo controle.
A figura 5 mostra que o maior enriquecimento de plaquetasocorreu no subgrupo de duas centrifugações 400 g + 400 g.
Os valores de volume de plasma obtido apresentados nafigura 6 são maiores com duas centrifugações (400 g por 10minutos + 800 g por 10 minutos).
A tabela 2 mostra que a quantidade de leucócitos resul-tante foi estatisticamente maior no controle em comparaçãocom os subgrupos com apenas uma centrifugação (p = 0,004 ep = 0,004) e com relação ao subgrupo com duas centrifugaçõesde 200 g e 10 minutos cada (p = 0,007). Já o subgrupo comduas centrifugações de 400 g e 10 minutos cada apresen-tou estatisticamente mais leucócitos do que os subgruposcom apenas uma centrifugação (p < 0,05) e do que o sub-grupo com duas centrifugações de 200 g e 10 minutos cada(p = 0,031).
A tabela 3 mostra que a quantidade de eritrócitos foiestatisticamente maior no controle do que nos demais sub-grupos (p < 0,05), com exceção apenas dos subgrupos de duascentrifugações de 200 g - 10min + 400 g - 10 min e de 200 g -10min + 800 g - 10 min (p = 0,192 e p = 0,056). Esses dois sub-grupos apresentaram estatisticamente mais eritrócitos do queos subgrupos de uma centrifugação e os subgrupos de duascentrifugações de 200 g e 10 min cada (p < 0,05).
Pela tabela 4, tem-se que a quantidade de plaquetas comduas centrifugações foi estatisticamente maior do que o
controle, com apenas uma centrifugação, e do que o subgrupocom duas centrifugações, com 200 g e 10 min cada (p < 0,05).
A tabela 5 mostra que o volume de plasma obtido se asse-melha estatisticamente ao comportamento das plaquetas. Ossubgrupos com duas centrifugações têm maior volume do queos demais subgrupos, com exceção do subgrupo com duascentrifugações, com 200 g e 10 min cada.
Pelas tabelas e figuras, tem-se que a quantidade de pla-quetas com duas centrifugações (subgrupo 400 g + 400 g) foiestatisticamente maior do que o controle, com apenas umacentrifugação, e do que o subgrupo com duas centrifugações,com 200 g e 10 min cada (p < 0,05); ocorreu concentração médiade plaquetas nesse subgrupo (400 g + 400 g) 11,30 vezes supe-rior em relação ao grupo controle.
Discussão
Na literatura encontramos técnicas de obtenção de plasmarico em plaquetas, como a primeira usada, que só era aplicávelem uma estrutura hospitalar com máquinas de plasmaferesee necessitava de um técnico especializado para manipulá-la.16O procedimento apresentava maior morbidade e necessitavade tecnologia sofisticada.
A busca de técnicas para a obtenção de PRP com cus-tos menores fez surgir alguns métodos mais simples, comtubos de ensaio e uma centrífuga comum, que permitem apreparação do plasma rico em plaquetas com custo muitomenor e em ambiente ambulatorial. Porém, esses métodos são
trabalhosos e necessitam de aprendizagem por parte de quemirá fazer o procedimento.
Os métodos existentes na literatura não alcançam as mes-mas concentrações plaquetárias. Algumas são insuficientespara melhorar a regeneração tecidual. Esses fatores podemjustificar muito do criticismo a respeito da eficácia e da apli-cabilidade do plasma rico em plaquetas.
Outro fator fundamental está relacionado com o anti-coagulante. Normalmente é usado o citrato de sódio 3,2%.O citrato de sódio capta os íons de cálcio do sangue e os
neutraliza e forma um composto denominado quelato queimpede a formação do coágulo. Além disso, o citrato de sódionão altera os receptores de membrana das plaquetas e conse-quentemente o processo de quelação pode ser revertido pormeio da adição do cloreto de cálcio para formação do gel deplaquetas.
A recente tecnologia permite o uso do PRP com pequenosvolumes de sangue, minimiza a necessidade de reinfusão decélulas vermelhas e os riscos associados. Contudo há poucainformação sobre a quantidade ideal de plaquetas para ummelhor reparo tecidual.
Na literatura encontramos diversos protocolos de obtençãodo PRP. O número de centrifugações (uma ou duas) dependerádo método a ser usado. Alguns autores sugerem com ape-nas uma centrifugação, enquanto outras referências indicamprotocolo de dupla centrifugação.
Qualquer protocolo de obtenção do PRP deve concen-trar plaquetas no seu nível máximo para que correspondaaos resultados clínicos relatados na literatura. Mas alémde uma alta concentração plaquetária com grande liberaçãode fatores de crescimento, é muito importante que sejamantida a integridade da plaqueta. Os fatores de cresci-mento devem ser liberados de plaquetas viáveis, uma vezque no ato de exocitose granular a plaqueta complete aestrutura terciária das proteínas do fator de crescimento.As plaquetas fragmentadas podem desgranular grandes
quantidade de fatores de crescimento, mas com efetividadediminuída.
No presente estudo comparamos o número de plaque-tas obtidos em sangue periférico submetidos a uma e duascentrifugações; o maior enriquecimento ocorreu no grupode duas centrifugações, Os resultados se confrontam, con-frontando os resultados com alguns trabalhos publicados naliteratura, como o do Calixto.
No estudo de Calixto,14feito em seres humanos, foram usa-dos tubos de ensaio com anticoagulante citrato de sódio a 3,2%e EDTA, que mostraram diferença na concentração de plaque-tas, maior quando se usava o citrato. Com base nesse fato,escolhemos somente o citrato como anticoagulante dos tuboscoletores.
Vendramin et al.19obtiveram plasma rico em plaque-tas de melhor qualidade por meio de duas centrifugações a400 g por 10 min + 800 g por 10 min. No nosso estudo, obti-vemos uma alta concentração plaquetária a 400 g + 800 g; noentanto, a maior quantidade de plaquetas foi obtida a 400 gpor 10 min + 400 g por 10 min. Isso mostra que a partir dessaforça pode ocorrer a lise de plaquetas, que influenciam suaconcentração final.
Diversos estudos foram feitos em humanos, coelhos e equi-nos; no entanto, não encontramos protocolos de centrifugaçãoem ratos. Com o estabelecimento de um protocolo de obtençãode PRP em ratos, que alcançou uma alta concentração plaque-tária, proporcionamos estudos futuros para avaliar a eficáciaclínica desse plasma rico em plaquetas. Novos estudos podemaparecer a partir desse protocolo que fizemos e expandir seuuso na regeneração nervosa, cicatricial e de enxertos ósseos eligamentares.
Conclusão
Foi possível obter uma alta concentração plaquetária, com téc-nica simples e viável, por meio de centrifugação do sanguetotal e uso de materiais corriqueiro, como tubos de coleta,seringas e agulhas. O método mais eficaz de obtenção de con-centrado de plaquetas ocorreu nas amostras submetidas aduas centrifugações (400 g por 10 minutos + 400 g por 10 minu-tos), nas quais ocorreu uma concentração média de plaquetas11,30 vezes superior em relação ao grupo controle.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
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