O uso de drogas antiinflamatórias não-esteróides (AINE) no tratamento de diversas afecções do sistema músculo-es-quelético é uma prática comum e eficaz, minimizando a formação de processos inflamatórios, reduzindo o edema e, conseqüentemente, as algias decorrentes da maioria das injúrias tissulares(1-3). No entanto, a utilização dessas drogas no tratamento de fraturas permanece pouco esclarecida(4).
Acredita-se que a administração de uma droga AINE após um trauma ósseo poderia impedir a regeneração dos tecidos lesados pela neutralização da biotransformação das prostaglandinas (PG)(5). Estudos realizados em animais verificaram os efeitos dos AINE no processo de consolidação de fratura, sem, entretanto, apresentar uniformidade metodológica, principal-mente quanto ao período do início da droga e o momento do sacrifício dos cobaias(6-17). Ro et al.(15), em 1976, estudaram os efeitos da indometacina no processo de consolidação de fraturas de fêmur de ratos. Concluíram que essa droga administrada por via oral (VO) na dose de 2 miligramas/quilograma/ dia (mg/kg/dia) causa grave retarde de consolidação em fraturas de fêmur de ratos. Allen et al.(6), em 1980, examinaram os efeitos da indometacina (1, 2 e 4mg/kg/dia por VO) e da aspirina (100, 200 e 300mg/kg/dia por VO) sobre o processo de consolidação de fratura em ratos. Observaram que ocorreu retarde de consolidação das fraturas, droga e dose-dependen-te, sendo estatisticamente significante para a indometacina e para a dose mais alta de aspirina, em relação ao grupo controle. Obeid et al.(13), em 1992, estudaram os efeitos do ibuprofeno nos processos de consolidação e remodelação óssea e cartilaginosa na articulação temporomandibular (ATM) de coelhos. Após quatro semanas da administração da droga AINE, os resultados indicaram que o ibuprofeno teve efeito de retarde sobre a consolidação óssea e cartilaginosa na ATM de coelhos. Por fim, Altman et al.(7), em 1995, estudaram os efeitos de duas drogas AINE no processo de consolidação de fraturas em ratos (30mg/kg/dia de ibuprofeno e 1mg/kg/dia de indometacina). Observou-se que ambas as drogas AINE retardaram a consolidação das fraturas, com retarde da maturação do calo.
O objetivo dos autores com este experimento foi investigar o efeito do tenoxicam nas etapas do processo de consolidação de fraturas de tíbia, utilizando um modelo experimental em ratos.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostra
Foram estudados 28 ratos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus), machos, com oito semanas de vida, pesando em média 100 gramas. Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos, dois deles com 12 ratos em cada (I, II) e um, com quatro (III). O grupo I serviu de controle, recebendo 0,1 mililitro (ml) de soro fisiológico a 0,9%, por via intramuscular (IM), em dose única diária. O grupo II recebeu 0,1ml de tenoxicam (o equivalente a 10mg/kg de peso), por via IM, em uma única dose diária. O grupo III recebeu 0,2ml de tenoxicam (20mg/kg de peso). O cálculo das doses do AINE baseou-se em trabalhos de Strub et al.(18,19) sobre o efeito antiinflamatório do tenoxicam em ratos, nos quais foi demonstrado que 10mg/kg foram efetivos na redução do edema agudo induzido por caulim. A inclusão do grupo III teve a finalidade de verificar o possível efeito de dose-dependência das drogas AINE, conforme demonstrado por Trancik et al.(20). Optou-se pela via IM do tenoxicam, pois Listrat et al.(21) mostraram ser esta forma de administração mais potente e mais rápida no combate aos quadros álgicos em geral, quando comparada com a via oral.
Os animais foram submetidos à anestesia inalatória com éter sulfúrico, tendo posteriormente sua tíbia esquerda fraturada na região diafisária manualmente e de forma fechada, sempre pelo mesmo pesquisador (VG). As fraturas não foram imobilizadas e os ratos não sofreram qualquer tipo de restrição à mobilidade, sendo mantidos em gaiolas apropriadas no Biotério do Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Durante todo o período do experimento foram oferecidas aos animais água e ração-padrão ad libitum. A metodologia empregada nesta pesquisa assemelha-se à utilizada por Giordano et al.(22) em estudo sobre a influência de drogas anticoagulantes no processo de consolidação de fratura em tíbia de ratos.
A administração das substâncias foi iniciada aproximadamente duas horas após a produção da fratura, nas dosagens citadas.
Os animais foram sacrificados de acordo com as normas recomendadas pela Conferência Européia para pesquisa em cobaias(23). Após anestesia inalatória com éter sulfúrico, os ratos tiveram sua coluna vertebral fraturada na região cervical, com três dias, uma, duas e quatro semanas após a produção da fratura. Esses intervalos entre a produção das fraturas e o sacrifício dos animais seguiram modelo experimental proposto por Udupa & Prasad(24). Esses autores identificaram quatro fases bem distintas no período de consolidação de fratura de ratos, quais sejam: 1ª semana, fase fibroblástica; 2ª semana, fase colágena; 3ª e 4ª semanas, fase osteogênica; e 5ª e 6ª semanas, fase de remodelação. Após o sacrifício, realizou-se dissecção cuidadosa da tíbia fraturada, preservando-se discreto envoltório muscular, com a finalidade de não atingir inadvertidamente o calo. Nos grupos I e II, três animais foram sacrificados em cada período estudado, enquanto no grupo III, um em cada período.
Droga
A droga empregada nesta pesquisa foi o tenoxicam. O tenoxicam é um derivado oxicam, classe de ácidos com atividade antiinflamatória, analgésica e antipirética(25). Caracterizase por ser um ácido fraco e que, comparativamente a outros AINE, é apenas ligeiramente lipofílico(1,26). É comercializado em várias apresentações, sendo sugerido que concentrações plasmáticas superiores a 5-6 microgramas/ml, obtidas em média após sete a dez dias de uso contínuo, fornecem resposta antiinflamatória satisfatória(25). Circula no plasma principalmente ligado a proteínas (albumina), em torno de 99%(2).
Análise histológica
A análise histológica foi realizada no Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, do Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro. Todas as peças foram fixadas em for-mol a 10% tamponado por cinco dias. Após a fixação, os fragmentos (tíbia fraturada com envoltório de partes moles) foram descalcificados em ácido nítrico a 5% por cinco dias, desidratados, clarificados e incluídos em parafina. Foram feitos cortes de cinco micrômetros de espessura, sagitalmente ao plano da fratura, com micrótomo Spencer® (American Optical). Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE), picromallory (PM) e alcian blue pH 2,5-safranina (AB), de acordo com metodologia descrita por Bancroft & Cook(27). A HE e o PM são usados para estudo da celularidade e da matriz extracelular, enquanto o AB mostra os proteoglicanos ácidos sulfatados e não-sulfatados, que refletem a atividade condrogênica. Utilizou-se neste estudo microscopia de luz.
O estágio da consolidação óssea foi determinado nos animais sacrificados após quatro semanas da fratura segundo sis-tema de classificação histomorfológica proposto por Allen et al.(6). O grau quatro representa a completa união óssea. No grau três, a união óssea não está completa devido à presença de pequena quantidade de cartilagem no calo. O grau dois caracteriza-se pela visibilização de uma ponte de cartilagem hialina bem formada, unindo os fragmentos principais (união cartilaginosa completa). O grau um representa união cartilaginosa incompleta, com retenção de elementos fibrosos na placa condral. Por fim, no grau zero ocorre ausência ou atraso no reparo da fratura, caracterizado pela presença de cartilagem entre os fragmentos e restos de hematoma ou outro fluido (pseudartrose).
RESULTADOS
Análise histológica
Grupo I (controle):
3 dias - as extremidades ósseas maduras (osso velho) estavam vivas, com osteócitos presentes. Observou-se matriz extracelular com linhas basófilas (blue line), apresentando início de condrogênese ao redor (sem proteoglicanos ácidos evidentes) e com tecido fibroso em grande quantidade (fase fibroblástica). Notaram-se ainda áreas de miosite, com restos musculares e células inflamatórias disseminadas, e a presença de grande hematoma fraturário (figura 1).
1 semana - entre as extremidades ósseas fraturadas, observou-se grande proliferação de fibroblastos, condroblastos e condrócitos, e pequena quantidade de colágeno. Na área central havia pequeno hematoma e restos de fibrina (figura 2).
2 semanas - a região do calo era de aspecto misto, com presença de cartilagem, área de ossificação endocondral e formação de osso novo (figura 3). Havia pequena quantidade de proteoglicanos ácidos nas áreas de ossificação.
4 semanas - presença de osso novo imaturo (fase osteogênica), sem proteoglicanos ácidos evidentes (figura 4).
Grupo II:
3 dias - aspecto semelhante ao grupo I (controle) no mesmo período. Fase fibroblástica, com grandes áreas de miosite e grande hematoma.
1 semana - calo fibrocartilaginoso e fibroso, com condrogênese no início (união fibroblástica). Nas áreas laterais observou-se início de osteogênese incipiente. Área extensa de hematoma.
2 semanas - presença de calo misto (fibroso, cartilaginoso e ósseo), sobretudo cartilaginoso, com elevação dos proteoglicanos ácidos. Extremidades ósseas fraturadas com restos de hematoma e de tecido necrótico (união fibrocartilaginosa) (figura 5).
?4 semanas - calo misto, sobretudo cartilaginoso. Extremidades ósseas com união cartilaginosa incompleta. Presença de proteoglicanos ácidos em menores níveis do que com 2 semanas. Não se visibilizou mais hematoma (união cartilaginosa) (figura 6).
Grupo III:
3 dias - extensa área de necrose, com grandes quantidades de osso morto e de miosite, sem proteoglicanos ácidos evidentes (figura 7).
1 semana - hematoma extenso por toda a lateral e calo fibroso pequeno. Fase fibroblástica com sinal mínimo de condrogênese, sem evidência de proteoglicanos ácidos.
2 semanas - não se obteve leitura histológica, conside-rando-se como resultado perdido.
?4 semanas - calo desorganizado, com remanescentes fibrosos no interior da placa cartilaginosa e restos de hematoma na lateral. União mista, com alguns locais de ponte óssea incompleta (figura 8).
Análise histomorfológica
Grupo I (controle): grau 4 (3 animais).
Grupo II: grau 2 (3 animais).
Grupo III: grau 1 (1 animal).
DISCUSSÃO
Os AINE são potentes analgésicos e antiflogísticos, impedindo grande parte do processo inflamatório desencadeado após um trauma, através da inibição da ciclooxigenase, uma enzima central na síntese das PG(1-3,25,28-30) . No entanto, seu mecanismo de ação na cicatrização de tecidos traumatizados permanece incerta. Em vários tecidos essas drogas causam retarde de cicatrização, como na pele(31) e na cartilagem(13). Em relação ao processo de osteogênese pós-fratura, estudos desenvolvidos em animais demonstraram efeito inibitório dos AINE, provavelmente pela neutralização da biotransformação das PG(6-17). Dekel et al.(32) encontraram níveis elevados de PG na musculatura que envolve uma fratura de tíbia em coelhos, reforçando a importância destas substâncias no mecanismo de osteogênese.
Em relação ao presente estudo, verificou-se que, em comparação com grupo controle (grupo I), que obteve união óssea completa após quatro semanas da produção da fratura (grau 4 de Allen et al.(6)), o grupo II obteve união cartilaginosa completa (grau 2 de Allen et al.(6)) e o grupo III, união cartilaginosa incompleta (grau 1 de Allen et al.(6)). Isso se deve, provavelmente em parte, ao efeito inibitório dos AINE sobre o processo de osteogênese estar diretamente relacionado ao início de seu uso e à dose-dependência(7,18,19). Ho et al.(10) testaram e confirmaram o efeito de dose-dependência das drogas AINE, estudando enxertos ósseos desmineralizados usados para preencher falhas ósseas em ulna de coelhos. Assim, observou-se no grupo III, no qual foi feita uma dose de AINE duas vezes maior, com início no dia da fratura, consolidação bem mais lenta que no grupo controle, com aparente atraso de duas semanas em relação a este. Após quatro semanas do estudo, o animal desse grupo apresentou um calo desorganizado, com restos de hematoma e união fibrocartilaginosa.
Utilizou-se como tempo de sacrifício dos animais estudo de Udupa & Prasad(24) sobre o processo de osteogênese em ratos. Na presente pesquisa não foi estudado o efeito do tenoxicam na fase de remodelação da fratura (5ª e 6ª semanas), uma vez que parece não haver efeito dos AINE durante esta fase do processo de consolidação(12,33). Ao invés, optou-se por estudar o calo ósseo no terceiro dia após a fratura. Keller et (12) demonstraram que uma quase completa inibição da síntese de PG ocorre após três dias do tratamento com a indometacina; no entanto, não observaram nenhum efeito dessa dro-ga no processo de remodelação em osso cortical. Além do estudo histológico, através de microscopia de luz, realizou-se análise histomorfológica do calo nos animais sacrificados na quarta semana de pesquisa. Acreditamos que uma avaliação microscópica qualitativa torna mais compreensível a análise histológica, uma vez que a segunda é puramente descritiva e, por vezes, difícil de ser corretamente entendida. Optou-se pela classificação de Allen et al.(6) por julgarmos que esta é mais simples e reprodutível que a de Ho et al.(10).
A escolha do tenoxicam deveu-se principalmente a sua comodidade posológica, com administração uma vez ao dia, além de ser um AINE bastante utilizado na prática clínica cotidiana(34). O cálculo da dose baseou-se em estudos de Strub et (18,19) e a via IM pareceu mais eficiente que as outras vias de administração do fármaco(21). O modelo e os métodos adotados neste trabalho experimental têm sido utilizados pelos autores em outros experimentos, mostrando-se eficazes e capazes de ser reproduzidos por outros investigadores.
Neste estudo, observou-se nítida influência do tenoxicam sobre o processo de consolidação de fratura em ratos, retar-dando-o, a exemplo de estudos prévios utilizando outras drogas AINE(6-11,14). Não obstante os AINE atuarem inibindo a consolidação de fraturas em animais, seu uso em pacientes com fraturas agudas permanece não esclarecido (Einhorn, T.A. comunicação pessoal, 1998).
CONCLUSÃO
O tenoxicam administrado por via IM retarda o processo de consolidação de fratura em tíbia de ratos, fechada e não imobilizada. Esse efeito inibitório ao processo de osteogênese está diretamente relacionado com a dose empregada.
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