A consolidação de fratura é um dos mais notáveis processos de reparação do corpo humano, porque dele resulta reconstituição do tecido lesado em outro semelhante à sua forma original(1).
A ação traumática que determina uma fratura acarreta, paralelamente, lesão das estruturas vizinhas, formando as-sim um conjunto de alterações, que compõe o complexo secundário(2).
A consolidação de fratura ocorre em três fases intima-mente integradas e seqüenciais: 1) inflamatória, durante a qual o tecido necrótico é removido; 2) reparatória, quando a rápida síntese de nova matriz ocorre; e 3) remodelação, na qual a desorganizada matriz da fase de reparo sofre processo de maturação, transformando-se em estrutura compacta e funcionalmente eficiente(3).
A ocorrência de lesões vasculares, promovendo hemorragia variável, além de proporcionar a formação de hematoma que envolve o foco de fratura, faz que os segmentos lesados fiquem, em suas extremidades, desprovidos de nutrição e evoluam para necrose(2-4).
O hematoma é organizado, com afluxo de polimorfonucleares e células pluripotenciais, fazendo com que o tecido fibrovascular do coágulo seja substituído por fibras de colágeno(5-7).
Seguem-se a reabsorção do tecido necrótico e a proliferação e diferenciação das células osteogenitoras, no periósteo, no endósteo e na medula óssea em fibroblastos e condroblastos e ou osteoblastos(2,3).
Durante a fase de reparação, as extremidades ósseas tor-nam-se gradualmente envolvidas pelo calo ósseo e, na fase de remodelação, ocorre reabsorção do calo ósseo e subseqüente orientação do osso trabecular ao longo das linhas de estresse(2).
Existem vários fatores que podem interferir no processo natural da consolidação óssea, podendo ser divididos em mecânicos e biológicos. Entre os fatores mecânicos encontramos: a intensidade do trauma; os diversos tipos de fraturas, fechadas ou abertas; a inadequada estabilização da fratura, seja por métodos conservadores ou cirúrgicos(8,9).
As causas biológicas estariam relacionadas às alterações ósseas locais ou sistêmicas, como deficiência de vascularização, doenças metabólicas, doenças carenciais, uso de medicamentos, dentre outras(2,4,9,10).
Em relação ao uso de medicamentos, a corticoterapia é uma das causas mais comuns de retarde de consolidação e pseudartrose, em uma fratura, osteotomia ou artrodese(11-17).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da corticoterapia prolongada em altas doses na formação do calo ósseo na fratura da tíbia de ratos, ressaltando as diferenças histomorfológicas encontradas nas diversas fases da consolidação da fratura.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram usados na pesquisa, realizada no Departamento de Histologia e Embriologia do Centro Biomédico da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), 50 ratos da raça Wistar (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, com peso médio de 120 gramas e 35 dias de vida.
Os animais foram divididos em dois grupos, chamados de A e B, cada um com 25 ratos, sendo os do grupo A submetidos a corticoterapia (hidrocortisona) diária, via subcutânea, na região abdominal, com agulha 13 x 4,5mm, com dosagem de 0,4mg/100g/dia, por um período de 30 dias. A dose de corticóide foi calculada baseando-se em uma quantidade imunossupressora elevada para o ser hu-mano (2mg/kg/dia de hidrocortisona). Os animais do grupo B serviram para controle e foram submetidos à administração de soro fisiológico, pela mesma via de administração que o grupo A, para criar as mesmas condições de estresse.
Os animais foram pesados semanalmente desde o início do trabalho, a fim de avaliar o ganho ponderal.
Após 30 dias da administração do corticóide (grupo A) e do soro fisiológico (grupo B), foi realizada manualmente, por mecanismo de flexão, em todos os animais, fratura completa da tíbia e fíbula direita na junção do 1/3 médio com 1/3 distal, após anestesia inalatória com éter sulfúrico. A fratura foi confirmada clinicamente. A corticoterapia (grupo A) e a infusão de soro fisiológico (grupo B) foram mantidas até o sacrifício dos animais.
Após o procedimento para produção da fratura, foram divididos em vários subgrupos, cada qual com cinco animais.
Todos os animais permaneceram em gaiolas (cada subgrupo com cinco animais em uma gaiola), sem imobilização ou restrição de movimentos, com água e ração padrão em quantidade adequada, em condições similares.
Cada subgrupo foi sacrificado, respectivamente, com: três dias (A1 e B1), sete dias (A2 e B2), 14 dias (A3 e B3), 21 dias (A4 e B4) e 35 dias (A5 e B5) após a produção experimental da fratura, para permitir a análise das diversas fases da consolidação óssea, segundo proposta de Udupa e Prasad. As peças foram preparadas para o exame histológico e estudo por imagem foi realizado com mamógrafo.
Após o sacrifício dos animais, cada peça dissecada para exame foi submetida a manipulação para avaliar a presença ou não de mobilidade no foco de fratura da tíbia e fíbula direita.
Preparo das peças
As tíbias fraturadas, juntamente com seu envoltório muscular, foram dissecadas e imersas em solução de formol a 10%. Por dificuldades técnicas, na realização do exame radiológico, apenas uma peça de cada subgrupo foi submetida a avaliação radiográfica com mamógrafo (20% das peças). As restantes foram processadas para análise por técnicas de microscopia óptica (80% das peças) em aumento de 40 e 100 vezes.
Técnica histológica
Após a fixação em formol a 10%, os fragmentos foram descalcificados em ácido nítrico a 5% por cinco dias, desidratados, clarificados, incluídos em parafina e cortados na espessura de cinco micrômetros com micrótomo Spencer (American Optical®). Os cortes foram corados com as técnicas de: hematoxilina-eosina (HE), Alcian Blue-Safranina O e Picro-Mallory.
Técnica radiológica
As peças representativas dos subgrupos A1, A2, A3, A4 e A5 foram colocadas lado a lado com distância entre si de 2cm, para realização do exame radiológico em um mesmo filme, para melhor comparação dos resultados. O mesmo procedimento foi adotado para as peças representativas dos subgrupos B1, B2, B3, B4 e B5.
A seguir, ambos os grupos foram submetidos ao exame radiográfico, realizado com mamógrafo GCE-Siemens®, utilizando a técnica de 30mAs, 25Kv, com 0,5 segundo de exposição e com 60cm de distância entre o filme e o foco de emissão. Optamos pela utilização do mamógrafo, pois este confere maior nitidez ao exame, permitindo melhor visualização dos sinais da consolidação óssea. Foram avaliados os sinais radiológicos de consolidação da fratura, como a presença ou não do calo ósseo e do traço de fratura(2,9).
RESULTADOS
O grupo A (corticóide) apresentou aumento de peso, em média, de 30g por semana; já o grupo B (controle) obteve ganho de 40g no peso corporal por semana. Apenas um animal do subgrupo A5 apresentou aumento de 100g na primeira semana de corticoterapia, depois manteve o mesmo padrão de ganho de peso dos outros animais.
Dois animais morreram após o início do experimento, do subgrupo B2 (sete dias) e A4 (51 dias). A causa da mor-te não foi detectada nos dois casos.
Foi constatado, após cinco semanas, que no grupo submetido à administração de corticóide todos os focos de fratura apresentavam mobilidade. No grupo controle, não ha-via mobilidade nos segmentos fraturados após cinco semanas.
Avaliação histológica
Grupo A (corticóide)
Na região entre as extremidades ósseas fraturadas após três dias (A1) observou-se grande quantidade de tecido conjuntivo fibroso e hematoma. Foi detectada escassa positividade para proteoglicanos ácidos (PGAs).
Após sete dias (A2), a área interóssea estava preenchida por tecido fibrocartilaginoso, com início de formação do osso imaturo (fig. 1). Esse tecido ósseo imaturo predominou nas áreas laterais.
No 14o dia (A3), o calo ósseo imaturo apresentava-se com áreas calcificadas e grande quantidade de tecido cartilaginoso com a mais alta positividade para PGAs.
Aos 21 dias (A4), observou-se a ponte óssea e queda acentuada de PGAs. As trabéculas ósseas tornaram-se mais espessas em relação ao subgrupo anterior (A3).
No 35o dia (A5), o calo ósseo permaneceu bem evidente, mas desorganizado e extenso, demonstrando certo re-tarde no processo de consolidação da fratura (fig. 2).
Grupo B (controle)
Na região das extremidades ósseas fraturadas após três dias (B1), foi observada extensa área de tecido fibroso com um grande hematoma, três vezes superior ao do grupo submetido a corticóide. Evidenciou-se também aumento de tecido cartilaginoso na maioria dos preparados histológicos em relação ao grupo em que foi administrado corticóide.
Após sete dias (B2), o calo ósseo apresentou-se imaturo e de aspecto semelhante ao do grupo A (fig. 3), com quantidade moderada de PGAs visualizados após coloração por Alcian Blue-Safranina O.
No 14o dia (B3), o calo ósseo imaturo aumentou em volume e havia formação de ponte óssea (osso imaturo). Apresentava grande positividade para PGAs e áreas cartilaginosas.
Após 21 dias (B4), o calo ósseo se apresentou menor, com o periósteo espesso, formação de osso imaturo lateralmente (perifericamente) ao osso maduro. Ocorreu espessamento das traves ósseas, sugerindo remodelação óssea e queda acentuada de PGAs.
No 35o dia (B5), o calo ósseo encontrava-se menor em relação ao grupo A, com grande formação de osso imaturo lateralmente, externamente ao foco de fratura (fig. 4), configurando a continuidade do processo de remodelação óssea.
Avaliação radiológica
Nas quatro semanas iniciais não foram evidenciadas diferenças radiológicas entre os grupos submetidos ao corticóide e ao soro fisiológico. A partir da quinta semana, o grupo em que foi administrado soro fisiológico (subgrupo B5) apresentou sinais radiológicos de consolidação (fig. 5), enquanto o grupo em que foi utilizado corticóide não demonstrou sinais de consolidação da fratura (fig. 6). O estudo radiológico limitou-se a apenas um caso de cada subgrupo A e B; portanto, obteve-se análise de apenas 20% dos casos.
DISCUSSÃO
Nesta pesquisa, a administração de corticóide foi iniciada 30 dias antes da produção da fratura. Com exceção de Blunt et al(11), que iniciaram três dias antes, e Murakami e Kowalewski(17), que começaram duas semanas antes, todos os autores mencionados deram início à corticoterapia no dia em que a fratura foi produzida. Nos trabalhos selecionados para este estudo, os autores utilizaram doses altas do medicamento sem correlação com a prática clínica. No presente trabalho, procurou-se empregar dose relativamente alta (0,4mg/100g de peso) quando comparada com a para seres humanos, porém suficiente para produzir alterações na consolidação da fratura de ratos, que, segundo Ragan et (19), são animais resistentes à corticoterapia. Procedeu-se dessa forma para que fosse possível avaliar o efeito da corticoterapia prolongada na consolidação óssea em humanos e, se possível, extrapolar esses resultados para a prática clínica.
Ao analisar o aumento de peso dos animais submetidos ao corticóide, evidenciou-se que estes apresentaram ganho ponderal menor quando comparado com o do grupo controle. Segundo alguns autores(12,14), esse resultado decorre de alterações anatomopatológicas nas supra-renais dos animais submetidos à corticoterapia.
Nesta pesquisa procedeu-se à avaliação da mobilidade no foco de fratura em todos os subgrupos, pois a presença ou não de mobilidade é um sinal clínico importante na con-solidação(2,9). Em nenhum dos trabalhos analisados os autores utilizaram esse teste para avaliar a consolidação. No presente estudo, os animais submetidos à corticoterapia apresentavam mobilidade no foco de fratura após 35 dias, sugerindo retarde na consolidação, enquanto o grupo controle demonstrava sinal de consolidação, já que, após 35 dias de evolução, não se verificava mobilidade no foco de fratura.
Na presente pesquisa, a observação de lâminas de peças anatômicas de animais com três dias após a fratura evidenciou que o grupo submetido ao corticóide, além de apresentar escassa positividade para proteoglicanos ácidos, também evidenciava hematoma pós-fraturário reduzido, correspondendo a um terço do tamanho, quando comparado com o grupo controle. Além disso, foi observada maior quantidade de tecido cartilaginoso no grupo controle, quando comparado com o grupo submetido ao corticóide. Tais achados são compatíveis com os de Sissons e Hadfield(12), porém diferentes daqueles encontrados por Blunt et al(11) e Key e Odell(13), que durante os quatro primeiros dias não observaram diferença entre os grupos.
Esses achados sugerem que o corticóide alterou a fase inflamatória(10) do processo de reparo da fratura, inibindo a formação do hematoma, provavelmente(12) por diminuição no fluxo sanguíneo e alteração na permeabilidade ca-pilar no foco de fratura(11). Em ambos os trabalhos(11,13) em que os achados foram diferentes, os autores usaram doses inferiores, por período menor, quando comparado com o presente experimento.
Murakami e Kowalewski(17) evidenciaram hematoma maior no grupo submetido ao corticóide na primeira semana pós-fratura; tal fato se deve, provavelmente, por terem iniciado a corticoterapia apenas 15 dias antes da produção da fratura, enquanto nós utilizamos o corticóide por 30 dias antes. Esse fato leva-nos a crer que o efeito da corticoterapia sobre a consolidação óssea é tempo-dependente.
No grupo submetido à corticoterapia sacrificado com sete dias após a fratura, a região entre os fragmentos ósseos foi preenchida por tecido cartilaginoso, com formação de tecido ósseo imaturo lateralmente ao foco de fratura, porém com quantidade de PGAs e de tecido cartilaginoso discretamente diminuída quando comparada com a do grupo controle.
Alguns autores(11,12,20) também evidenciaram diminuição na quantidade de tecido cartilaginoso após o quarto dia de fratura nos animais que utilizaram corticóide. Isso foi atribuído ao efeito inibitório do corticóide na resposta do tecido conjuntivo ao trauma(11), levando a diminuição da quantidade de tecido cartilaginoso produzido.
No 14o dia, o grupo que utilizou corticóide apresentava grande quantidade de tecido cartilaginoso, diferentemente do grupo controle, no qual já havia pontes ósseas (osso imaturo). Em ambos os grupos, nessa fase foi encontrada a mais alta positividade para PGAs. Esses achados são compatíveis com os de Sissons e Hadfield(12) e Hulth e Ole-(15), que notaram atraso no desenvolvimento do calo ósseo nos animais submetidos ao corticóide, nos quais havia a formação de calo cartilaginoso maior, que levava mais tempo para ser substituído por osso trabecular. Esse fato decorre, provavelmente, do efeito inibitório do corticóide sobre o desenvolvimento vascular(12,15), levando à formação de um ambiente com baixo aporte de oxigênio, favorecendo a formação de tecido cartilaginoso e retardando a formação de osso imaturo.
Após 21 dias, no grupo submetido ao corticóide as trabéculas ósseas tornaram-se mais espessas em relação ao período anterior (14 dias), porém, no grupo controle, o periósteo apresentava-se espessado e com formação de osso imaturo circundando o osso maduro. Uma característica de ambos os grupos nessa fase foi a queda acentuada nos PGAs. Ragan et al(19) não evidenciaram nenhum tipo de alteração histológica, argumentando que, além de os animais utilizados em nosso experimento (ratos) serem muito resistentes ao corticóide, a dose utilizada deveria ser grande o suficiente para produzir diferença na consolidação da fratura. Já Follis(21) verificou que não houve aumento na atividade das células periosteais no grupo submetido à corticoterapia, estando de acordo com o nosso resultado. Segundo Murakami e Kowalewski(17) ocorreu atraso na diferenciação dos condroblastos três semanas pós-fratura, pois a quantidade de tecido cartilaginoso era pequena quando comparada com a do grupo controle. Os achados mencionados nessa fase (21 dias) mostraram que, nos animais do grupo controle, o calo estava menor e com características da fase de remodelação(18), ou seja, a fratura estava em franca união, enquanto no grupo submetido ao corticóide o processo de consolidação estava retardado.
No 35o dia do experimento, no grupo submetido ao corticóide o calo ósseo apresentava-se desorganizado e mais volumoso, porém com pouca formação de osso imaturo lateralmente, apresentando, assim, sinais histológicos de pseudartrose, enquanto o grupo controle mostrava continuidade do processo de remodelação. Esse fato foi também descrito por Kostenszky e Oláh(22), que após 40 dias de evolução evidenciaram calo ósseo com maior quantidade de tecido cartilaginoso, indicando atraso no processo de ossificação. Segundo Follis(21), não foi encontrada alteração na formação de osso endosteal na diáfise de ratos jovens. Em alguns trabalhos(11,12,15) foi verificado que havia retarde na consolidação óssea do grupo submetido ao corticóide, fato este também confirmado por Bernick e Er-shoff(23). Stanisavljevic et al(24) concluíram que havia alteração da matriz óssea, com conseqüente inibição da calcificação. Murakami e Kowalewski(17) relataram que, apesar de haver retarde na produção do tecido cartilaginoso até a terceira semana pós-fratura, a partir deste ponto ocorre progressiva substituição por tecido ósseo, com consolidação da fratura idêntica à do grupo controle, após a quinta semana de fratura.
Em nosso experimento, o resultado difere do acima mencionado, provavelmente porque submetemos os animais ao uso do corticóide por um período duas vezes maior que o de antes da produção da fratura, quando comparado com o trabalho de Murakami e Kowalewski(17).
Esse fato corrobora a idéia de que os efeitos da corticoterapia sobre a consolidação óssea variam quanto ao tempo e a dose empregada do medicamento (tempo/dose-de-pendente).
O grupo controle apresentava sinais radiológicos de consolidação (calo ósseo exuberante e não visualização do foco de fratura), assim como ausência de mobilidade no foco de fratura, o que não foi evidenciado no grupo submetido ao corticóide, após 35 dias de evolução (subgrupos B5 e A5, respectivamente). Esses achados revelam que, enquanto no grupo controle a fratura estava consolidada clínica e radiologicamente após cinco semanas de evolução, no grupo submetido ao corticóide havia retarde da consolidação.
O processo de consolidação pode ser alterado por inúmeros fatores, inclusive por diversos medicamentos, como antiinflamatórios não hormonais e hormonais. Segundo Giordano Neto(25), após o uso de antiinflamatório não hormonal, o processo de neoformação óssea está mais propenso a ser alterado durante a fase de citodiferenciação. Apesar de a droga por nós utilizada ser o corticóide (antiinflamatório hormonal), as alterações encontradas em nos-sa pesquisa são semelhantes às desse autor e, em nossa opinião, também decorrentes de inibição na diferenciação celular que ocorre na fase inflamatória da consolidação.
Apesar de, após cinco semanas de evolução, não ser evidenciada a consolidação da fratura no grupo submetido à corticoterapia e, dessa maneira, sugerindo que pudesse evoluir para pseudartrose, tal observação merece ser um pouco mais explorada em experimentos futuros. Nestes poderia haver seguimento mais longo para que fosse possível realmente afirmar se haveria ou não evolução para pseudartrose.
CONCLUSÃO
A corticoterapia prolongada em altas doses interferiu no processo de reparo da fratura, diminuindo a formação do hematoma fraturário, limitando a fase inflamatória. Retardou a produção do tecido cartilaginoso e a sua posterior substituição por osso trabecular, promovendo certo retarde do processo de consolidação da fratura.
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