Às portas do terceiro milênio, cada vez se falava mais de substâncias que poderiam ajudar na recuperação de um nervo lesado. Termos como fatores neurotrópicos e co-fa-(1,2,3) estavam ficando cada vez mais comuns na prática clínica. Neste trabalho, procuramos estudar o efeito de uma dessas substâncias, os gangliosídios. Desde a sua descoberta, em 1935(4), ainda não se estabeleceu o seu verdadeiro papel na regeneração nervosa. Apesar de diversos trabalhos terem demonstrado que aceleraria o processo de regeneração nervosa(5,6,7), através do aumento do brotamento axonal (sprouting)(8) e do número de fibras mielínicas(9,10,11), ainda não é um consenso sua utilização na prática clínica(12,13).
Através de um estudo experimental prospectivo e du-plo-cego em ratos, procuramos avaliar o efeito dos gangliosídios quando administrado via intraperitoneal por 30 dias. A avaliação dos grupos foi feita funcional e histomorfometricamente. A função foi avaliada através do teste da marcha introduzido por De Medinaceli et al(14) e modificado por Bain et al(15). Esse teste avalia o índice de função do ciático (IFC) através das pegadas das patas trasei-(16,17,18,19). Histomorfometricamente, a avaliação foi feita através do cálculo da densidade de fibra, percentagem de tecido neural e área média de uma fibra dos nervos lesados(20,21).
MATERIAL E MÉTODOS
No estudo foram utilizados 32 ratos da raça Wistar divididos em dois grupos com 16 ratos cada. Todos os ratos utilizados eram machos. A idade (média de 99 dias) e peso (média de 365g) dos ratos foi semelhante nos dois grupos. Tivemos o cuidado de escolher uma população de ratos a mais homogênea possível, para que a influência da idade e de fatores hormonais fosse a menor possível. Todos os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral a 10% intraperitonealmente (400mg/kg) e submetidos à exploração do nervo ciático através de via de acesso dorsal, entre as fibras do músculo glúteo. A técnica cirúrgica da lesão nervosa e da coleta dos fragmentos do nervo ciático foi rigorosamente a mesma nos dois grupos estudados. Tivemos o cuidado de escolher uma via de acesso cirúrgico em que não houvesse nenhuma desinserção ou secção muscular, para que a avaliação funcional através do teste de marcha não fosse prejudicada(22). Realizou-se o esmagamento do nervo ciático com o auxilio de um porta-agulha padrão por um minuto a 6mm da trifurcação do nervo (fig 1). Após esse procedimento efetuou-se o fechamento do plano muscular e da pele. Os animais receberam a partir do primeiro dia de pós-operatório, até o 30º dia, doses diárias intraperitoneais de solução de gangliosídios (30mg/kg) ou solução tamponada, dependendo do grupo. Só ficamos sabendo o que recebeu cada grupo após terem sido realizadas todas as avaliações funcionais e histomorfométricas.
GRUPO A: Gangliosídios
GRUPO B: Solução tamponada
Avaliação funcional
A avaliação funcional foi realizada no pré-operatório, na primeira, quarta e sexta semanas de pós-operatório, através da análise do teste de marcha introduzido por De Medinaceli et al(14) e modificado posteriormente por Bain et (15). Neste teste, procede-se à pintura das patas traseiras das cobaias com tinta preta. Coloca-se a cobaia para deambular num corredor sobre uma folha de papel sulfite (fig. 2). O teste de marcha leva em conta os seguintes parâmetros:
Tamanho da pata (TP): distância medida em milímetros da ponta do calcâneo até a ponta do terceiro dedo.
° Separação dos dedos (SD): distância medida em milímetros entre a ponta mais medial do primeiro dedo até a ponta mais lateral do quinto dedo.
° Separação intermédia (SI): distância medida em milímetros entre a ponta mais medial do segundo dedo e a ponta mais lateral do quarto dedo.
Acrescentamos o sufixo O para identificar o lado opera-do, que em todos os casos foi o esquerdo e o sufixo N para identificar o lado normal (direito) não operado.
O índice de função do ciático foi calculado através da fórmula:
Avaliação histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada com seis semanas de lesão nervosa após sacrifício dos animais. Analisamos porções proximais e distais à lesão, assim como o lado normal contralateral. Os cortes histológicos foram examinados através da microscopia óptica sob imersão e aumento de 1.000x. Os índices estudados foram os seguintes:
Densidade fibra (DF): corresponde ao número de fibras mielínicas presentes na área de um retículo (expresso fibras/10.000µm2).
° Percentagem de tecido normal (PTN): corresponde à parte da área do corte que está sendo estudado que é ocupada por fibras mielínicas. A PTN é calculada pelo número de pontos do retículo que incidem sobre as fibras mielínicas dividido pelo número total de pontos do retículo (expresso em percentagem).
° Área média de uma fibra (AMF): corresponde à divisão da PTN pela DF (expressa em x 100µm2).
RESULTADOS
Excluímos das avaliações todos os ratos que apresentaram deiscência de sutura, contraturas das patas traseiras, amputação de qualquer um dos dedos ou morte durante o trabalho. A população final do grupo A foi reduzida a nove ratos e a do grupo B, a 11 ratos. Excluímos da avaliação funcional os ratos (quatro de cada grupo) que não conseguiram imprimir pegadas de boa qualidade na primeira se-mana.
Apresentamos no gráfico 1 a evolução do índice de função do ciático por grupo.
Apresentamos em seguida (gráficos 2, 3 e 4) os resultados dos achados histomorfométricos.
Resumo dos resultados
1) Não encontramos diferenças significativas com relação ao grau de recuperação motora avaliado através do teste de marcha entre os dois grupos.
2) Os dois grupos estudados apresentam recuperação motora completa após quatro semanas de lesão nervosa.
3) Não encontramos diferenças significativas com relação aos parâmetros densidade de fibra, percentagem de tecido neural e área média de uma fibra entre os dois grupos estudados.
4) As fibras nervosas regeneradas na porção distal da lesão são de menor calibre que as fibras proximais.
5) Existe aumento de tecido conjuntivo perineural ao redor dos axônios na porção distal da lesão, o que acarreta diminuição da percentagem de tecido neural.
DISCUSSÃO
Hoje em dia, é cada vez maior o número de substâncias que supostamente agiriam na regeneração nervosa melhorando o resultado clínico(2,3,8). Criam-se em alguns pacientes falsas expectativas quanto ao verdadeiro potencial de recuperação em lesões nervosas graves.
Nossa intenção foi simular experimentalmente uma situação com que, por muitas vezes, nos defrontamos na prática clínica, que é a lesão nervosa sem secção completa do nervo(22). Os gangliosídios, apesar de descobertos há quase 65 anos(4), ainda não tiveram seu papel bem definido na prática clínica(12,13). Após a primeira referência por Ceccarelli et al(11) de que os gangliosídios acelerariam o processo de regeneração do sistema nervoso in vivo, diversos autores começaram a estudar suas implicações no sistema nervoso periférico(6,7,8,9,10,12,13).
Optamos pelo esmagamento do nervo para simularmos uma lesão do tipo axoniotmese, na qual não existe secção completa do nervo(23). Podemos observar macroscopicamente na figura 1 que existe perda da continuidade axonal na região do esmagamento, porém, o invólucro epineural foi preservado. O teste de marcha presta-se muito bem para avaliar, quantitativamente(15,16,17,18), a recuperação motora dos membros inferiores após uma lesão nervosa. Nossa idéia foi avaliar funcionalmente nossos ratos através do teste de marcha para que pudéssemos comparar com os resultados histológicos e observar se existem diferenças entre os resultados.
Analisando os gráficos 1, 2 e 3, notamos não haver diferenças significativas entre o grupo que recebeu a solução de gangliosídios e o da solução tamponada. Existiu diferença entre os parâmetros histomorfométricos estudados, em relação ao local onde foram colhidos os fragmentos de nervo ciático. A densidade de fibra (DF) da região proximal não apresentou diferenças significativas em relação à da região distal. Isso se deve, provavelmente, aos cortes terem sido feitos na região do brotamento axônico. Outro dado que corrobora essa observação é a de que a DF da região distal foi maior do que a da região normal. O nível de coleta dos fragmentos de nervo ciático da região distal e o da região normal foram os mesmos. A percentagem de tecido neural (PTN) e a área média da fibra (AMF) compor-taram-se de maneira semelhante durante a avaliação histomorfométrica. Os dois parâmetros diminuem quando comparamos a região distal com a proximal. Distalmente, existe menos tecido neural, além de as fibras nervosas serem de calibre menor. Quando comparamos as fibras proximais e distais com as do lado normal, a diferença de tamanho é nítida. As fibras normais são bem mais calibrosas, além de apresentar bainha de mielina mais espessa.
Não existe consenso na literatura quanto à utilização dos gangliosídios na prática clínica. Alguns trabalhos(6,8,9,10,11) demonstram haver melhora da regeneração nervosa, enquanto outros mostram justamente o contrário(12,13). Salientamos que a comparação desses trabalhos é muito difícil, já que as metodologias são totalmente diferentes. Não existe padronização quanto à dosagem ideal (de 5 a 50mg/kg), via de administração (local na lesão, intraperitoneal ou subcutâneo) e mecanismo de lesão nervosa (secção total ou só esmagamento do nervo). Utilizamos em nosso trabalho a dose intermediária de 30mg/kg pela via intraperitoneal numa tentativa de simularmos a administração realizada em humanos.
CONCLUSÃO
A solução de gangliosídios na dosagem de 30mg/kg administrado intraperitonealmente por 30 dias não apresentou nenhum efeito importante sobre a regeneração nervosa de ratos após lesão por mecanismo de esmagamento.
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