Um aspecto crítico da pesquisa utilizando lesão medular em ratos é a padronização da avaliação da recuperação motora. Tarlov (1954) propôs uma avaliação neurológica em que se atribuíam valores de zero a cinco para a graduação dos movimentos do animal(1). A escala de Tarlov tem sido modificada por muitos pesquisadores para a obtenção de detalhes quanto à capacidade motora do animal e para isso utilizam-se outros critérios como rampas inclinadas, análise de marcha e nado. A performance e a coordenação motora geralmente são avaliadas com mais sucesso que a função sensorial(2).
A escala de avaliação motora pode ser simples e não analisar todos os aspectos necessários, como observado na escala de Tator(3), ou ser abrangente demais, como a escala de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB), preconizada pela Ohio State University (OSU), o que dificulta a interpretação dos dados. A BBB envolve a observação e o escore de 10 comportamentos incluindo tórax, cauda e as patas traseiras direita e esquerda. Observa-se, então, o movimento dos membros (quadril, joelho e tornozelo), a posição da musculatura do tórax, a disposição da musculatura do abdômen, a coordenação das patas dianteiras e traseiras, a presença de instabilidade do tórax, a posição da cauda do animal para cima ou para baixo, a incidência do arrastamento das patas traseiras e a presença de rotação ou desvio das garras e se, ao caminhar, eles utilizam mais a parte dorsal ou plantar da pata traseira(4,5). Além de extensa, essa avaliação traz grande variação na interpretação, tanto inter como intra-obser-vador, mesmo se repetida várias vezes no mesmo animal. Surgiu, então, a necessidade de um método também abrangente, porém mais simples, para avaliar a recuperação motora dos animais lesados medulares.
Objetivos - O objetivo deste trabalho é testar um mode-lo de escala de avaliação motora para a lesão medular experimental tendo como base testes já apresentados(1,4,5) e avaliar sua aplicabilidade no protocolo do Laboratório de Lesão Medular e Trauma Experimental do HUC-PUC-PR.
MATERIAL E MÉTODOS
Utilizaram-se 20 ratos Wistar, machos, adultos jovens, com peso variando entre 350 e 450g, procedentes e acondicionados no Laboratório de Lesão Medular e Trauma Experimental do HUC-PUC-PR. Os animais foram mantidos com controle de luz (ciclo claro-escuro de 12 horas), à temperatura ambiente (de 25 ± 1ºC), com água e ração (Nuvilab CR1-Nuvital, Colombo, PR) ad libitum. Os experimentos seguiram as normas do Mascis (Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study)(4).
Dividiram-se aleatoriamente os animais em dois grupos. O primeiro (n = 10) foi submetido a uma lesão medular contusa equivalente à queda de uma haste de 10g de altura de 25mm em área seccional de 2mm2. O grupo controle (n = 10) sofreu apenas laminectomia sem lesão do saco dural.
Todos os animais foram anestesiados intraperitonealmente (ip) com tiopental sódico (Cristalia) na dose de 75mg/ kg, cinco minutos previamente ao experimento; foram, então, submetidos a tricotomia e anti-sepsia com solução de PVP-I (Laboratório Farmacêutico do Cajuru). Procedeuse, então, à incisão de aproximadamente 5cm de pele e subcutâneo sob a linha média da região dorsal, seguindose o afastamento subperiostal da musculatura paravertebral. Após essa exposição, realizou-se laminectomia ao nível de T9 e T10 sem lesão do saco dural, com o uso de um minissacabocado.
Fixou-se o animal por clamps no aparelho Impactor NYU acoplado a PC com software específico que analisa as variáveis do trauma, permitindo, assim, a sua padronização. Com esse aparelho, dados como a velocidade da queda da haste, o momento do impacto e, principalmente, a compressão sofrida pela medula são monitorados e expressos sob a forma de gráficos. O resultado desse gráfico determina se a lesão ocorreu dentro dos parâmetros predeterminados pelo protocolo do Mascis para que o animal possa ser incluído no estudo. Realizou-se uma lesão contusa equivalente à queda de uma haste de 10g de altura de 25mm em área seccional de 2mm2. Após o trauma contuso, os animais foram suturados, acondicionados isoladamente e submetidos à expressão vesical manual de 12/12 horas pelo método de Credé. Todos os animais receberam antibiótico cefazolina (Lilly) na dose de 1mg/dia por 48 horas após a lesão.
Procedeu-se à avaliação motora dos animais no sétimo, 14o e 21o dia após a lesão medular. Os testes usados foram adaptados do escore combinado de comportamento utilizado em ratos submetidos a lesão medular experimental(6). Em casos de diferença no escore das patas traseiras, utili-za-se o menor valor. O quadro 1 descreve cada teste e estabelece valores para as respostas obtidas.
No 21o dia os animais foram submetidos à eutanásia com tiopental sódico (Cristalia) na dose de 100mg/kg (ip), seguida de perfusão intracardíaca com solução fisiológica até a completa exsanguinação. Após, procedeu-se à infusão de 300mL de solução de formalina tamponada 10% (pH 6,8, com 4,5g/L de fosfato monobásico de sódio e 6,5g/L de fosfato dibásico de sódio), fixando os tecidos para posterior estudo.
RESULTADOS
Durante o ato cirúrgico houve pouca perda sanguínea. Observou-se autofagia em dois animais e apenas três morreram nas primeiras 24 horas pós-trauma, dados equivalentes aos encontrados na literatura(7).
No teste de escala motora (gráfico 1) observou-se recuperação motora em todos os animais comparando a primeira e a terceira avaliação. Cinco animais apresentaram melhora progressiva no decorrer das quatro avaliações. Houve piora em dois, sendo esta observada em um deles entre a primeira e a segunda avaliação (rato 2) e a outra entre a segunda e terceira (rato 3).
No teste de reflexo em extensão dos dedos (gráfico 2), observou-se melhora progressiva entre a primeira e a terceira avaliação em quatro dos sete animais avaliados.
No testes de retirada em extensão (gráfico 3), observouse a recuperação ou manutenção do reflexo de retirada da pata traseira manualmente contra o corpo em todos os animais. Notou-se a manutenção do valor encontrado em três animais. Nos demais ocorreu melhora significativa, chegando ao terceiro dia de avaliação com valores variando entre 1 (movimento lento contra o corpo) e 3 (hiperflexão da pata traseira com tremores).
No reflexo a estímulo doloroso (gráfico 4) não observamos dados que possibilitem comparações, pois ocorreu aleatoriamente melhora e piora dos resultados ao longo das três avaliações. Apenas um animal (rato 6) não apresentou alteração.
Na resposta à ventralização (gráfico 5) os únicos escores obtidos foram 2 (retorno médio à posição prona) e 3 (rápido retorno à posição prona), sendo que em cinco desses animais não houve alteração desde a primeira avaliação. Nos outros dois animais ocorreu aumento no escore de 2 para 3 em momentos distintos.
No teste de resposta ao toque da pata traseira com barra (gráfico 6) notou-se que na primeira avaliação apenas um animal manifestou reação. Na terceira avaliação, no entanto, seis dos sete animais manifestaram resposta, que variava de escassos movimentos até a capacidade de segurar a barra, mesmo que de modo fraco.
No grupo controle não houve perda motora nem sensitiva em nenhuma das três avaliações.
Somando-se as pontuações (gráfico 7), observou-se claramente recuperação da função em todos os animais.
É importante ressaltar que o rato 3 apresentou alterações no estado geral, com hematúria e até piúria, o que definitivamente influenciou de forma negativa na sua recuperação. Os animais do grupo controle apresentaram pontuação máxima em todos os testes nas três avaliações.
DISCUSSÃO
Vários modelos experimentais foram desenvolvidos para avaliar os mecanismos patofisiológicos da lesão medular, comparações funcionais, morfológicas e eletrofisiológicas verificadas em ratos lesados medulares que se assemelham a dados encontrados nos seres humanos(8).
O modelo de contusão apresenta uma vantagem clinicamente importante, pois a maioria das lesões medulares em humanos envolve dano tecidual devido a rápidos movimentos da coluna vertebral com impacto ósseo contra a medu-(9). Outra vantagem do modelo é o fato de ser preconizado e reprodutível; isso é particularmente importante para examinar agentes terapêuticos e protocolos de tratamento dignos de procedimentos clínicos. O comportamento da função motora após a contusão da medula sofre profundas alterações, mas é possível a sua quantificação com o desenvolvimento de escalas como a de Tarlov(10). É interessante a obtenção de grupos de animais com diferentes níveis e tempo de lesão correspondendo a pacientes com déficit funcional suave, moderado e grave. Pacientes em geral apresentam piora nas funções autonômicas(16) proporcionalmente à energia do trauma. Lesões sensoriais e do trato motor são evidenciadas pela perda da função sensorial e paresias, que podem ser avaliadas por exames neurológicos, de acordo com a American Spinal Injury Association (ASIA)(11).
A escala BBB é um sistema de 21 pontos baseados em características funcionais que sugerem a recuperação progressiva da paralisia até a locomoção normal(12). Obser-varam-se significantes diferenças entre os movimentos realizados pelos ratos que sofreram apenas laminectomia daqueles que sofreram grave contusão, indicando que a BBB é válida e possui alto grau de sensibilidade. Essa escala é extensa, o que dificulta a análise em experimentos utilizando grupos numerosos de animais, fator esse que motivou a elaboração de um escore reduzido.
Vários estudos, relacionando os achados motores aos histológicos, comprovam que a percentagem de tecido medular disponível está estreitamente ligada à recuperação motora(12,13,14,15,16,17,18,19).
Basso et al obtiveram resultados sugerindo que apenas 5 a 10% das fibras no centro da lesão são suficientes para ajudar a direcionar circuitos segmentares envolvidos na produção da locomoção básica. Observou-se, também, que a maior parte dos ratos com trauma grave ou transecção é incapaz de suportar o peso do corpo com as patas traseiras, apenas realizando movimentos isolados de articulação(20).
A recuperação motora após lesão parcial da medula está associada a alterações nos sistemas medulares descendente do tronco cerebral e segmentar. Esses sistemas diferen-ciam-se pelas formas de locomoção. O sistema descendente do tronco cerebral é responsável pela locomoção testada na escala BBB (locomoção acima da superfície)(20).
Basso et al mostraram que essas poucas fibras são responsáveis pela recuperação em níveis mínimos e intermediários com lesão de 50 e 25mm, respectivamente(20).
O aparelho Impactor NYU é capaz de produzir de forma padronizada lesões com a queda da haste de alturas de 12,5, 25 e 50mm. Optou-se por realizar lesões de 25mm, pois houve alta mortalidade em ratos lesados com 50mm (10% de sobrevida em sete dias) e porque lesões de 12,5mm comprometiam a aplicabilidade dos testes, pois os animais apresentavam recuperação quase completa em sete a 10 dias.
Os autores avaliaram a recuperação motora de forma prática e comparativa, utilizando apenas seis testes. No teste A os dois valores máximos de escala não foram encontrados no experimento. Ressaltamos, no entanto, o fato de o valor 4 já indicar recuperação muito boa do animal, neste teste; notou-se que todos os animais melhoraram, compa-rando-se a primeira e a terceira avaliação. No teste B os resultados encontrados foram pouco conclusivos, pois da segunda para a terceira avaliação, cinco animais obtiveram valores inalterados enquanto que, se se observar da primeira para a terceira, cinco aumentaram de valor. O teste C demonstrou validade, pois conseguiu detectar e mensurar o grau do reflexo em todos os animais nas três etapas.
O teste D é de fácil realização, porém obtivemos dados aleatórios que dificultam nossa interpretação. No teste E não se observou variação em cinco dos sete animais durante o experimento, podendo, assim, ser considerado um teste de pouca validade. Não se pode determinar, no entanto, se isso se deve à subjetividade da avaliação ou à pouca recuperação motora. O teste F não se mostrou eficaz na primeira e na segunda avaliação (valores nulos), apresentou resultados consideráveis apenas na terceira avaliação, sendo seu uso indicado somente para esse período (21 dias).
Observamos nos gráficos 7 e 8 (somatório dos testes A, C e F) resultados semelhantes, sendo que a recuperação é melhor visualizada no gráfico 8.
CONCLUSÃO
Esse modelo de avaliação motora quantifica de maneira satisfatória a recuperação das funções motoras em três dos seis testes. Apesar de preconizada com freqüência na literatura, não há necessidade de avaliação tão extensa, pois os testes (B, D e E) não influenciaram na avaliação final.
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