Os meniscos são estruturas de vital importância para boa função e preservação da articulação do joelho. Na presença de lesão, a sutura é o tratamento de eleição, segundo a literatura(1,2,3,4), porém, não é aplicável a todos os casos. Quando os critérios para sutura não forem preenchidos, a meniscectomia parcial ou total deve ser realizada. Apesar de os resultados desse procedimento a curto prazo serem satisfatórios(5,6,7), principalmente devido à baixa morbidade cirúrgica e rápida reabilitação, as conseqüências a lon-go prazo relacionadas à degeneração articular são bastante conhecidas(8,9).
Com o objetivo de evitar as conseqüências da meniscectomia, outra opção terapêutica pode ser utilizada. Trata-se do transplante de menisco, primeiramente realizada em pacientes, em 1984, por Milachowski et al(10). Apesar de o transplante ser uma terapêutica recente, o aparecimento de uma opção que venha ocupar essa lacuna no tratamento das lesões de menisco faz com que o procedimento venha merecendo o interesse; vários estudos experimentais têm sido realizados, tentando responder a questionamentos e dúvidas. Com o intuito de melhor aprendizado e entendimento dessas questões, tais estudos têm-se mostrado alia-dos importantes e imprescindíveis para chegar a um transplante de menisco ideal.
Dessa maneira, optamos por realizar um trabalho experimental em coelhos, utilizando enxertos congelados mantidos a -80ºC, que seriam retirados dos próprios animais e transplantados em coelhos diferentes, simulando os transplantes homólogos, com o objetivo de avaliar a viabilidade e os resultados deste transplante, procurando criar assim uma condição real, que seria no futuro a encontrada, quando empregada em humanos.
MATERIAL E MÉTODO
Utilizamos para nosso experimento, realizado na Unidade de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, 12 coelhos brancos e machos da raça Nova Zelândia. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, sob temperatura ambiente, com fornecimento de ração e água à vontade(11). Em todos os casos o menisco medial do joelho direito foi o experimental e, o do esquerdo, utilizado como grupo controle. O experimento foi dividido em três fases, realizadas durante um período total de três meses.
Fase 1: Realizada a retirada do menisco medial do joelho direito, armazenado em recipiente individual e mantido à temperatura de -80ºC.
Fase 2: Após 30 dias da primeira fase, o menisco foi reimplantado em um coelho diferente, na ordem que se segue: menisco do coelho 1 reimplantado no coelho 2 e vice-versa; menisco do coelho 3 reimplantado no coelho 4 e vice-versa; e assim sucessivamente com os restantes.
Fase 3: Após 60 dias da segunda fase, os coelhos foram sacrificados e os meniscos submetidos a análise macroscópica. Foram avaliados o tamanho, o aspecto e a cicatrização periférica, sendo classificados como normais, quando apresentavam o mesmo tamanho e aspecto comparando-se com o grupo controle (joelho contralateral), e alterados, quando possuíam tamanho menor ou aspecto diferente. Quanto à cicatrização periférica, foi classificada como total, quando todo o menisco se encontrava fixo à sinovial, e parcial, quando pelo menos um dos terços do menisco não se apresentava aderido. Em seguida, os meniscos foram incluídos em parafina e realizado um corte no plano frontal em seu terço médio. Foram corados, então, pela hema-toxilina-eosina e analisados sob aumento de 160x. Na análise microscópica, realizada no Serviço de Anatomia Patológica da Santa Casa de São Paulo, avaliaram-se a disposição das fibras colágenas, o tipo de célula encontrada e sua distribuição, e a presença ou não de processo inflamatório, que equivaleria a um sinal histológico de rejeição do transplante. A disposição das fibras colágenas foi classificada como ordenada ou não; quanto à distribuição das células, foi observado se elas se encontravam na periferia, nas superfícies tibial e femoral, na região central ou em todo o menisco.
Técnica cirúrgica
Fase 1: Os coelhos foram mantidos em jejum alimentar por um período de 12 horas e hídrico por seis horas. Previamente à anestesia, foi realizada antibioticoterapia com penicilina procainada (Ariston) na dose de 40.000U/kg/ (12), mantida por mais dois dias após o procedimento. Os animais foram também pesados, com variação de 2,6 a 3,4kg. Na anestesia, realizada pela médica veterinária, uti-lizou-se a associação de tiletamina e zolazepan (Virbac) na dose de 0,4ml/kg com fentanil-droperidol (Janssen-Ci-lag) na dose de 0,3ml/kg administrados na mesma seringa, via intramuscular, no membro posterior. Essa associação tem um período hábil de 40 a 60 minutos. Quando o procedimento ultrapassava esse período, uma segunda dose anes-tésica era feita, utilizando-se metade da dose inicial. O animal foi mantido em respiração espontânea, com máscara de oxigênio com fluxo constante de 2,5 l/min(12).
Com o coelho anestesiado realizamos a tricotomia de todo o membro posterior direito, desde a raiz da coxa até a pata do animal, sem porém incluí-la. Procedemos, então, à anti-sepsia com solução de polivinilpirrolidona-iodo (Ceras Johnson®) e, em seguida, à colocação de campos estéreis, deixando a pata do animal isolada com faixa de crepe. Iniciamos o procedimento através de uma incisão longitudinal parapatelar medial medindo em torno 4,0cm. Dissecamos o tecido celular subcutâneo, até a perfeita exposição da cápsula articular medial. Esta foi incisada juntamente com a membrana sinovial, seguindo-se os padrões da abertura da pele. Luxamos a patela lateralmente e flexionamos o joelho, obtendo assim boa exposição articular. Discreto esforço em valgo e flexão do joelho foram suficientes para conseguir a abordagem do menisco medial. Utilizamos bisturi lâmina nº 15 e tesoura de argola reta de 11cm para realização da meniscectomia total. Após a sua retirada, os meniscos foram mensurados em seu maior eixo; o tamanho, em todos os animais, foi de aproximadamente 1cm. Os meniscos foram colocados em pequenos sacos feitos de papel e plástico estéreis com dimensões de 4 x 3cm, lacrados com esparadrapo, também estéril. Cada conjunto foi novamente armazenado em um novo invólucro de plástico duro, circular, de 5cm de comprimento. Após identificação com números para cada um dos meniscos, estes foram levados para o congelador (Revco®) da Unidade Estratégica do Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Santa Casa de São Paulo, e mantidos à temperatura de -80ºC.
Procedemos, então, à redução da luxação da patela e ao fechamento da cápsula articular e pele com pontos separados, com fio mononylon 5.0 preto (Ethicon®).
Após o procedimento, os animais foram levados para a sala de recuperação, onde observamos os tempos de período pós-anestésico. Com a recuperação total, eles foram devolvidos às suas gaiolas. Os animais foram mantidos à temperatura ambiente, alimentados com ração e água. Foram feitos curativos diários com soro fisiológico a 0,9%, mantidos sem oclusão, até a retirada dos pontos, no sétimo dia após a cirurgia.
Em todos os animais o pós-operatório evoluiu sem intercorrências, com curativos de bom aspecto e sem infecção.
Fase 2: Após 30 dias do primeiro procedimento, realizamos a segunda fase do experimento. Repetimos as etapas da primeira fase quanto a jejum, anestesia, antibioticoterapia, assepsia e anti-sepsia. O peso dos coelhos nesta fase variou de 3,7 a 4,2kg. Realizamos a mesma incisão de pele e abertura da cápsula articular com exposição do joelho através da luxação lateral da patela.
Os meniscos foram retirados do congelador e dos dois invólucros em que se mantinham armazenados, e colocados em um recipiente com solução salina (soro fisiológico a 0,9%) à temperatura ambiente, para que ocorresse seu descongelamento por um período de 20 minutos.
Em seguida, foram reimplantados em coelhos diferentes, sendo o menisco do coelho no 1 colocado no no 2, e vice-versa; o menisco no 3 colocado no coelho no 4 e vice-versa, e assim sucessivamente com o restante dos coelhos.
A sutura dos meniscos foi realizada através de pontos passados de dentro para fora da articulação(13), utilizandose de fio mononylon 6.0 preto (Ethicon®). Foram realizados dois pontos, o primeiro na região entre o corno anterior e o terço médio do menisco, e o segundo entre o terço médio e o corno posterior (fig. 1). Após a passagem dos pontos através da cápsula, afastamos a pele para a região posterior, obtendo assim perfeita visualização da saída dos quatro fios. Procedemos, então, à fixação do menisco através da amarragem dos fios, que permaneceram no tecido celular subcutâneo.
O fechamento da cápsula, pele e curativo, seguiu os moldes da primeira fase. Mantivemos também o mesmo protocolo quanto aos curativos e retirada de pontos. Da mesma maneira da fase anterior, não houve intercorrências pós-operatórias, com os curativos, de aspecto limpo e sem infecção.
Fase 3: Após 60 dias da segunda fase, os coelhos foram sacrificados com acepromazina (Univet ®) 1mg/kg IM, como medicação pré-anestésica e, após 10 minutos, foi administrado o tiopental sódico (Abbott) em superdosagem de 30mg/kg intracardíaco(12). Os meniscos foram assim submetidos à análise macroscópica e microscópica.
RESULTADOS
Macroscopia
Observamos que 10 dos 12 meniscos transplantados apresentavam cicatrização total, pois encontravam-se aderidos à cápsula articular através de sua porção periférica em toda sua extensão (fig. 2). Dois meniscos (coelhos no 2 e no 4) apresentavam cicatrização parcial, com o corno posterior e terço médio desinseridos e fixos apenas pelo corno anterior (fig. 3).
Quanto ao tamanho, os meniscos que apresentaram cicatrização parcial (coelhos no 2 e no 4), além do coelho no 5, possuíam comprimento menor (0,5; 0,3 e 0,7cm, respectivamente) quando comparados com o grupo controle (fig. 4). Os nove meniscos restantes possuíam dimensões semelhantes às dos meniscos controles.
Outro menisco (coelho no 8) apresentou solução de continuidade em seu terço médio, estendendo-se até a periferia capsular. Contudo, os cornos anterior e posterior en-contravam-se aderidos à sinovial e seu tamanho não se encontrava alterado (tabela 1).
Microscopia
Na avaliação histológica (tabela 2) de nosso experimento encontramos nos 12 meniscos a presença de dois tipos de células dispostas entre as fibras colágenas. Uma com núcleo circular, com característica compatível com o fibroblasto, e um segundo tipo de célula, com núcleo mais alongado e fusiforme, caracterizando o fibrocondrócito (fig. 5). Não houve, porém, o predomínio de um grupo sobre o outro em todas as lâminas analisadas. Quanto à distribuição, também não se evidenciou localização preferencial dos grupos celulares, seja na região periférica do menisco, ou na região central, e, sim, distribuição relativamente homogênea por todo o menisco.
Quanto à matriz extracelular, encontramos, em todas as lâminas, fibras colágenas dispostas de maneira irregular, em feixes desordenados (fig. 5), diferente da distribuição ordenada observada no grupo controle (fig. 6).
Em relação ao aspecto imunológico, não observamos, em nenhum dos meniscos transplantados, características histológicas compatíveis com rejeição do enxerto. Em apenas um menisco (coelho no 10) encontramos a presença de alguns linfócitos dispostos entre as fibras colágenas. Porém, o aspecto geral não apresentava diminuição do número das células do menisco, nem hipertrofia sinovial, apenas um desarranjo nas fibras colágenas semelhante aos demais meniscos. Macroscopicamente, achava-se aderido à sinovial e de dimensões normais quando comparados com o grupo controle.
DISCUSSÃO
Segundo autores(14,15,16), podemos observar nos meniscos de animais como cães, cabras e ovelhas um padrão histológico muito semelhante ao encontrado em humanos, caracterizado por um tecido fibrocartilaginoso, composto por entrelaçado de fibras colágenas interpostas por fibrocondrócitos. Ghadially et al(17) descreveram em coelhos, que foi o animal utilizado em nosso experimento, o mesmo padrão histológico acima mencionado. Por serem animais de fácil obtenção, baixo custo de manutenção, de médio porte, facilitando o alojamento, tornou-se a nossa opção nessa pesquisa. Em relação ao tipo de enxerto empregado, existem na literatura três tipos mais utilizados para transplantes de menisco: os autólogos, os artificiais e os homólo-(18), sendo o último grupo o grande alvo das pesquisas, por serem opções biológicas, apresentarem remodelação tanto nos estudos experimentais(16) como nos achados clí-nicos(19) e manterem as propriedades biomecânicas do menisco original. Porém, esses resultados estão também diretamente ligados à maneira pela qual os meniscos, após ser retirados de seu doador, são armazenados, podendo ser congelados (-80ºC), criopreservados, liofilizados e frescos.
Em nosso experimento retiramos o menisco medial do joelho direito dos coelhos, na primeira fase, mantendo-os à temperatura de -80ºC por 30 dias. Após esse período, os meniscos foram reimplantados em animais diferentes (segunda fase). Dessa maneira, procuramos reproduzir e simular as condições em que o enxerto homólogo congelado é realizado em humanos. Optamos por um enxerto biológico, que utiliza o próprio menisco, que, em condições de armazenamento (-80ºC), cumpre as suas funções, além de possuir custo acessível.
Um dos pontos importantes na técnica cirúrgica realizada em pacientes, para o sucesso do procedimento, é a fixação estável dos enxertos. Em nosso experimento os meniscos foram fixados à cápsula articular através de duas suturas de dentro para fora(13), utilizando-se de mononylon 6.0. A primeira através do corno posterior e terço médio, e a segunda, através do terço médio e corno anterior. Essa foi a maneira realizada para estabilizar o menisco, já que, em um animal do porte de um coelho, a feitura de túneis tibiais torna-se um procedimento de difícil realização. Observamos que 10 dos 12 meniscos transplantados encon-travam-se cicatrizados e aderidos à cápsula articular através de sua porção periférica. Dois meniscos (coelhos no 2 e no 4) apresentavam desinserção do corno posterior e terço médio, permanecendo fixos apenas pelo corno anterior. Um terceiro menisco (coelho no 8) apresentou solução de continuidade em seu terço médio estendendo-se até a periferia capsular. Os cornos anterior e posterior encontravam-se fixos. Quanto ao tamanho do menisco, além da alteração citada nos espécimens anteriores, o coelho no 5 possuía comprimento menor (0,7cm), comparando-se com o tamanho original. Os demais oito meniscos restantes possuíam as mesmas dimensões originais.
Nossos resultados coincidem com os trabalhos experimentais da literatura, que também mostram um índice alto de cicatrização do menisco ao hospedeiro, apesar de al-guns casos de soltura do corno posterior(14,16,20). Acreditamos que a não cicatrização do corno posterior não ocorreu em dois casos de nossa série (coelhos no 2 e no 4), principalmente, por problemas técnicos, em se tratando de casos operados na fase inicial da pesquisa, quando à pouca familiaridade com o procedimento se somava a fragilidade das duas suturas feitas com fio no 6.0.
Na avaliação histológica, em nosso experimento encontramos dois tipos de células dispostas entre as fibras colágenas, o fibroblasto e o fibrocondrócito. Esse achado identifica um processo de diferenciação celular, já que o fibroblasto é uma célula precursora do fibrocondrócito. Quanto à distribuição, não se notou uma localização preferencial dos grupos celulares, seja na região periférica do menisco, ou na região central, e, sim, um aspecto relativamente homogêneo.
Uma das questões levantadas na literatura diz respeito ao processo de remodelação histológica pelo qual passa o menisco ao ser transplantado. Sabe-se que técnicas de armazenamento à temperatura de -80ºC (menisco congelado) levam à morte de todas as células, porém sem alterar as características da matriz colágena(21). Já os meniscos criopreservados possuem a capacidade de manter em torno de 10% das células de origem ao ser transplantados. Portanto, qual seria a origem das células encontradas nos meniscos transplantados? Seriam decorrentes de diferenciação de células do próprio menisco? Seriam resultado da proliferação e diferenciação de células da membrana sinovial do hospedeiro em fibrocondrócitos? A tese mais aceita, confirmada por Arnoczky et al(14), Jackson et al(15) e também observada por outros autores como Mikic et al(16,22) e Fabbriciani et al(21), é de que a reabitação do menisco ocorre através de células provenientes do hospedeiro, que invadem o transplante e se diferenciam em fibrocondrócitos. Arnoczky et al(14), após eliminarem todas as células do menisco a ser transplantado, utilizando alta temperatura (196ºC), observam e identificam os estágios de repopulação celular. Na primeira semana após o transplante, nenhuma célula foi observada no menisco. Em torno da segunda semana, notou-se a presença de células na superfície tibial e femoral do menisco, com concentração maior próxima à periferia sinovial. Eram de aspecto poligonal e mononucleares. Por volta do primeiro mês as células fo-ram observadas por toda a superfície tibial e femoral, bem como em camadas mais profundas do menisco e também eram de aspecto poligonal. No terceiro mês, já havia uma distribuição mais homogênea, permanecendo acelular apenas o centro do menisco. As células eram de aspecto poligonal e também fusiformes (fibrocondrócitos). Por fim, no sexto mês, a maioria das células era composta por fibrocondrócitos, distribuídos por todo o menisco, com exceção da região central.
Esse movimento de migração de periferia para região central do menisco, sugerindo que a invasão celular seja feita pelo hospedeiro, é confirmado por Jackson et al(15), que evidenciaram a presença do DNA do hospedeiro nas células do menisco transplantado, em trabalho experimental realizado em cabras. Debeer et al(23) comprovam os achados de Jackson(15), agora através da análise de um menisco lateral criopreservado transplantado em um indivíduo de 32 anos. Um ano após o transplante, também encontraram o mesmo DNA do receptor no enxerto de menisco.
Apesar de nossos cortes histológicos terem sido realizados no segundo mês, eles se assemelham bastante aos achados descritos por Arnoczky et al(14) no terceiro mês. A presença e a distribuição de fibroblastos e fibrocondrócitos por todo menisco sugerem que este esteja sofrendo um processo de reabitação celular e remodelação, mesmo que este processo não tenha sido confirmado em cortes histológicos em fases evolutivas.
Quanto à matriz extracelular, encontramos, em toda as lâminas, as fibras colágenas dispostas de maneira irregular, em feixes desordenados, diferente da distribuição ordenada observada no menisco controle. Tal achado também é compatível com a literatura consultada. Arnoczky et (14) também observaram alteração na arquitetura do colágeno do menisco. Isso foi evidenciado através da perda da orientação normal de algumas fibras, tanto superficiais como profundas. Segundo os autores, essa desorganização, principalmente no terceiro mês, poderia representar uma alteração temporária decorrente de um processo de remodelação normal. Questionam se esse padrão tecidual estaria relacionado com a capacidade dos novos fibrocondrócitos de sintetizar matriz colágena normal. Porém, após seis meses o padrão encontra-se praticamente normal, não interferindo nas características biomecânicas do transplante.
Do ponto de vista imunológico, a reação contra o enxerto ocorre mais precisamente contra os antígenos presentes em sua células. As técnicas de armazenamento como congelamento e liofilização, que se caracterizam por levar à morte das células presentes, a princípio causariam menor reação imunológica do hospedeiro contra o enxerto. Asso-cia-se a isso o fato de o menisco ser uma estrutura privilegiada por possuir densa matriz extracelular que isolaria as suas células do sistema imunológico do hospedeiro. Dessa maneira, sinais histológicos de reação imunológica contra enxertos congelados(14,22,24) e mesmo os criopreservados(25) não foram encontrados nos trabalhos experimentais citados.
Em nossa revisão da literatura, os maus resultados clínicos não foram relacionados à reação imunológica contra o enxerto. Milachowski et al(10) correlacionam seus três maus resultados, num total de 22 transplantes, com um caso de infecção e dois casos de instabilidade residual do LCA. Garrett et al(26), em sua série de 28 meniscos criopreservados e 16 congelados, acreditam que seus maus resultados ocorreram em transplantes realizados em articulações com alterações degenerativas avançadas. De Boer e Koudstaal(27) relatam três maus resultados num total de 25 enxertos criopreservados, sendo em dois por haver deformidade em varo associado e outro pela presença de instabilidade ligamentar.
Encontramos apenas um relato em nossa revisão bibliográfica no qual os autores(28) observam sinais evidentes de rejeição do menisco transplantado. Chamam a atenção para um transplante criopreservado de menisco realizado em um paciente de 33 anos, que após dez semanas de cirurgia apresentava quadro de dor importante. Submetido à retirada do enxerto, o que se observou na análise histológica foi a per-da da orientação das fibras colágenas, com proliferação e penetração da membrana sinovial no menisco. Havia diminuição importante no número de fibrocondrócitos, contrastando com um denso infiltrado linfocitário e algumas células gigantes. Esse aspecto, segundo os autores, seria típico de rejeição, apesar de não terem sido realizados testes de histocompatibilidade entre o doador e receptor.
Em relação aos nossos resultados, apenas um menisco (coelho no 10) mostrou a presença de alguns linfócitos. Porém, o aspecto geral não apresentava hipocelularidade nem hipertrofia sinovial, apenas um desarranjo nas fibras colágenas compatível com o processo de remodelação no segundo mês. Macroscopicamente, achava-se aderido à sinovial e de dimensões normais, comparando com o grupo controle.
No restante dos meniscos não foram observadas alterações que sugerissem qualquer processo de rejeição ao enxerto.
A curto prazo, este experimento demonstrou a viabilidade de uma nova terapêutica cirúrgica, na tentativa da manutenção das funções dos meniscos. Trata-se do início de uma nova série de indagações sobre a integração do transplante a longo prazo, a conservação das qualidades físicas de tal enxerto e, portanto, de sua segura indicação dentro da cirurgia ortopédica.
CONCLUSÕES
1) O transplante homólogo de menisco congelado manteve as características biológicas do menisco original, em relação ao tamanho e aspecto, além de apresentar cicatrização periférica na membrana sinovial.
2) No transplante homólogo de menisco congelado, não foi evidenciado aspecto de rejeição imunológica, do ponto de vista histológico.
3) O transplante homólogo de menisco congelado após ser reimplantado sofre um processo de remodelação caracterizado pela presença de células precursoras ao fibrocondrócito, como o fibroblasto, e também pela disposição irregular das fibras colágenas, no 60o dia de pós-operató-rio.
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