O uso de drogas antiinflamatórias não-esteróides (AINEs) vem sendo implicado como responsável pelo surgimento de retarde de consolidação e pseudartrose após fraturas utilizando modelos experimentais em animais(1). Investigações prévias têm sugerido dois importantes fatores como determinantes do atraso no processo de reparo ósseo: a administração precoce das drogas e o efeito da dose-de-pendência. Embora o mecanismo de ação das drogas AINEs no processo de osteogênese permaneça desconhecido, Altman et al(2) observaram que a neoformação óssea pode ser influenciada tanto pelo tempo entre a produção da fratura e o início da administração das drogas quanto pela freqüência com que estas drogas são administradas. Törnkvist et (3) afirmam que, após o início da fase de ossificação endocondral, a ação de fatores exógenos, como as drogas AI-NEs, não é comum, refletindo provável atuação dos AINEs durante a fase de diferenciação das células osteoprogenitoras(4). Quando uma droga AINEs é administrada ocorre inibição da prostaglandina G/H sintetase, uma importante enzima envolvida na síntese das prostaglandinas(5). Embora o papel das prostaglandinas no processo de formação óssea não esteja completamente definido, inúmeros autores acreditam que seu principal mecanismo de ação seja promover a reabsorção óssea(6,7). Keller et al(8) demonstraram que, durante o reparo de fraturas, osteoclastos e osteoblastos encontram-se intimamente ligados, sugerindo que a reabsorção das bordas da fratura provavelmente estimula a diferenciação das células perivasculares pluripotenciais indiferenciadas, assegurando rápido restabelecimento da função esquelética.
Recentemente, com o lançamento pela indústria farmacêutica dos AINEs inibidores seletivos da ciclooxigenase (COx), diversas vantagens vêm sendo demonstradas sobre os AINEs ditos tradicionais, principalmente com relação à proteção do aparelho digestivo(9,10). No entanto, pouco ou nada foi relatado acerca de prováveis diferenças existentes entre os AINEs tradicionais e os inibidores seletivos da COx2 durante o processo de reparo ósseo. Na presente investigação estudamos os efeitos do tenoxicam e do meloxicam no processo de consolidação e de remodelação ósseas em fraturas de tíbia de ratos.
MATERIAL E MÉTODOS
Preparo dos animais: Trinta e seis ratos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus), adultos, fêmeas, com peso médio de 200g, foram utilizados neste experimento. Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos. Após anestesia intraperitoneal com tiopental sódico 10g na dosagem de 1,6mg/kg de peso(11), foi produzida uma fratura fechada no terço médio da diáfise da tíbia direita, manualmente, sempre pelo mesmo pesquisador, através da técnica de "três pontos" (three-point bending)(1,12,13,14) (fig.1). As fraturas não foram imobilizadas e os animais foram alojados em gaiolas apropriadas no Biotério do Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, com água e ração-padrão ad libitum. O grupo 1 (n = 13) recebeu 10mg/kg/dia de tenoxicam 20mg intramuscular (0,2ml/dia)(15). O grupo 2 (n = 13) recebeu 0,12mg/kg/dia de meloxicam 15mg intramuscular (0,25ml/ dia)(16). O grupo 3 (n = 10) recebeu 0,2ml/dia de soro fisiológico 0,9% intramuscular, sendo utilizado como grupo controle. A administração das substâncias iniciou-se imediatamente após a produção das fraturas e continuou durante todo o experimento.
Após anestesia inalatória com éter sulfúrico, os animais foram sacrificados por decapitação(17,18,19) na quarta e na sexta semanas após as fraturas terem sido realizadas, o que representa as fases de consolidação e de remodelação, res-pectivamente(20). Sete cobaias dos grupos 1 e 2, e cinco do grupo 3 foram sacrificados na quarta semana. O restante dos animais foi sacrificado na sexta semana.
Preparo do calo ósseo: As extremidades fraturadas fo-ram desarticuladas através do joelho, sendo a tíbia dissecada preservando-se o envoltório de partes moles adjacente ao calo ósseo (fig. 2). Logo após, as peças foram colocadas em frascos apropriados contendo formaldeído a 10%. O tecido ósseo foi fixado durante cinco dias.
A análise histológica foi realizada sob microscopia ótica (Olympus ®BHs-RFCA, Japão). Após a fixação, os fragmentos foram descalcificados em ácido nítrico a 5% por mais cinco dias, desidratados em álcool e incluídos em parafina. Foram realizados cortes de 5µm e confeccionadas lâminas coradas pela hematoxilina-eosina (HE) e picromallory (P), segundo metodologia descrita por Bancroft e Cook(21).
A análise histomorfológica foi realizada na quarta e na sexta semanas do experimento. Utilizando-se as mesmas lâminas da avaliação histológica, analisadas em seqüência aleatória, sem conhecimento do regime terapêutico empregado, o estágio de reparo ósseo foi determinado por dois histologistas através de uma escala de cinco pontos, proposta por Allen et al(22) (quadro 1).
Drogas: As drogas utilizadas nesta pesquisa foram o tenoxicam 20mg (AINE tradicional) e o meloxicam 15mg (AINE inibidor seletivo da COx-2). As doses escolhidas seguiram trabalhos prévios usando essas substâncias, nos quais ocorreu controle satisfatório do processo inflamatório em ratos da linhagem Wistar(15,16).
Análise estatística: A análise histomorfológica do estágio do reparo ósseo(22) permitiu a realização de análise estatística entre os grupos experimentalmente estudados, utilizando-se o teste de Kruskall-Wallis, com nível de significância a = 0,05. Comparações pareadas entre o grupo controle e os grupos que usaram as drogas AINEs foram realizadas através do teste de Mann-Whitney, com nível de significância a = 5%(23,24). Análise da força do atual estudo foi demonstrada prospectivamente para valores do p obtidos com nível de significância a = 5% (com força maior do que 80% (ß < 0,2))(25).
RESULTADOS
Análise histológica: Após quatro semanas de fratura, observou-se união óssea completa nos animais do grupo controle (n = 5), caracterizada pela presença de grande quantidade de tecido ósseo imaturo entre as extremidades ósseas fraturadas e periósteo moderadamente espesso (fig. 3). Os grupos 1 (tenoxicam, n = 7) e 2 (meloxicam, n = 7) apresentaram aspecto histológico semelhante, com presença de grande quantidade de calo misto (fibrocartilaginoso e ósseo) e desorganizado, composto predominantemente de tecido cartilaginoso unindo as extremidades ósseas fraturadas, e periósteo espesso e reativo (união cartilaginosa completa) (figs. 4 e 5). Um animal do grupo 1 (tenoxicam) evoluiu com calo extremamente desorganizado, contendo restos de hematoma, tecido fibroblástico e vasos em abundância, demonstrando atraso importante do processo de consolidação de fratura (pseudartrose) (fig. 6).
Ao término de seis semanas de pesquisa, todos os animais do grupo controle (n = 5) apresentaram aspecto de remodelação do calo, com redução da quantidade de osso imaturo e formação do sistema haversiano entre os extremos ósseos fraturados, dificultando em vários cortes a diferenciação entre o osso preexistente e o tecido neoformado (fig. 7). Nos grupos 1 (tenoxicam, n = 6) e 2 (meloxicam, n = 6), notou-se grande quantidade de osso imaturo, com ilhas de tecido cartilaginoso esparsamente distribuídas, unindo as extremidades ósseas fraturadas e periósteo levemente espesso. Alguns animais dos grupos que utilizaram drogas AINEs tinham calo que se assemelhava ao do grupo controle com quatro semanas de experimento (união óssea completa) (figs. 8 e 9); em outros, os restos de tecido cartilaginoso no interior do osso neoformado eram mais abundantes (condrogênese in foci), caracterizando união óssea incompleta.
Análise histomorfológica
Quatro semanas:
Grupo 1 (tenoxicam) - grau 0 (um animal), grau 2 (seis animais)
Grupo 2 (meloxicam) - grau 2 (sete animais)
Grupo 3 (controle) - grau 4 (cinco animais)
Seis semanas:
Grupo 1 (tenoxicam) - grau 3 (um animal), grau 4 (cinco animais)
Grupo 2 (meloxicam) - grau 3 (um animal), grau 4 (cinco animais)
Grupo 3 (controle) - grau 4 (cinco animais), em processo de remodelação
Análise estatística
Utilizando o teste de Kruskall-Wallis com a = 0,05, houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos estudados (p = 0,001). Comparações pareadas entre o grupo 3 (controle) e os grupos 1 (tenoxicam) e 2 (meloxicam) demonstraram que os AINEs empregados no atual experimento retardam o processo de consolidação óssea de forma estatisticamente significativa, com p = 0,01. No entanto, não ocorreu diferença estatisticamente significativa entre os grupos que utilizaram as drogas AINEs (p > 0,05).
DISCUSSÃO
A administração de drogas AINEs tradicionais a diferentes animais tem demonstrado atraso na consolidação de fratura. Recentemente, Giordano et al(1,14) observaram a influência do tenoxicam no processo de reparo ósseo após fratura de tíbia em ratos. O calo ósseo foi estudado em quatro fases distintas durante 28 dias de experimento. Esses autores demonstraram retarde da osteogênese, mais pronunciada quanto mais precocemente foi iniciada a medicação. Uma das fraquezas desse experimento foi o pequeno número de animais (n = 3) empregados por Giordano et al(14), o que, do ponto de vista estatístico, diminui o impacto dos achados. Além disso, o calo não foi estudado na fase de remodelação, a qual ocorre por volta da quinta e sexta semanas. No presente estudo, foram utilizados o tenoxicam e o meloxicam, droga AINE inibidora seletiva da COx-2. O tecido ósseo neoformado foi analisado histologicamente com quatro (fase osteogênica) e com seis (fase de remodelação) semanas. Por fim, foi usado um número maior de cobaias durante a pesquisa.
Tem sido proposto que as ciclooxigenases exercem funções fisiológicas distintas, com sua expressão regulada de forma independente em cada tecido(26,27,28). Em teoria, a utilização de AINEs inibidores seletivos da COx-2 traria benefícios principalmente relacionados à diminuição da toxicidade gástrica. A COx-1 existe normalmente nos mais diversos tecidos, sendo responsável pela produção de prostaglandinas (PG), que desempenham importante papel nas funções homeostáticas, como manutenção da integridade da mucosa gástrica e da função plaquetária(27,28). Seibert et (28) demonstraram por meio de análise in vitro de cultura de células humanas a presença da enzima COx-1 no trato gastrintestinal. A COx-2 mantém níveis basais muito pequenos, tendo sua expressão aumentada em determinadas condições patológicas do organismo, como processos inflamatórios e neoplásicos(27,28). A participação das PG na inflamação é de extrema importância, especialmente no desenvolvimento e na manutenção do edema e da dor, da quimiotaxia e da agressão tecidual(1,6,29). Embora o papel das PG na formação óssea não esteja completamente definido, há evidências de que inibem a síntese de colágeno e promovem a reabsorção óssea, eventos fundamentais durante o reparo de fratura(6,7,29). Quando uma droga antiinflamatória é administrada, independente de sua ação seletiva, ocorre especificamente a inibição da enzima COx-2 no sítio do processo inflamatório, levando à inibição das PG, em especial da PGE-2(30,31,32,33,34,35,36). Isso promove redução substancial da reabsorção da matriz óssea e pode ser uma das razões da diminuição da diferenciação celular no calo. Giordano et al(4) demonstraram que a diferenciação de células osteoprogenitoras em osteoblastos é o evento fundamental do processo de regeneração óssea.
Em nosso estudo, observamos que tanto o tenoxicam quanto o meloxicam retardaram o processo de reparo ósseo. Após quatro semanas de pesquisa, ocorreu formação de ponte óssea completa nos animais do grupo 3 (contro-le), enquanto nos grupos 1 (tenoxicam) e 2 (meloxicam) houve formação de ponte cartilaginosa completa. Giordano et al(14) encontraram resultados similares em seu experimento com o tenoxicam. Com seis semanas de experimento, o grupo 3 (controle) apresentou padrão histológico de remodelação do calo ósseo. Nos grupos 1 (tenoxicam) e 2 (meloxicam) foi notada presença de ponte óssea completa na maioria dos animais, com aspecto bastante semelhante ao do grupo controle após quatro semanas de fratura. Per-cebeu-se atraso de cerca de duas semanas entre o grupo controle e os grupos que utilizaram AINEs. Isso nos leva a crer que a ação das drogas AINEs empregadas ocorreu nas fases iniciais do reparo ósseo, conforme sugerido por Törnkvist et al(3). Entretanto, esse atraso não impediu a consolidação, o que se fez em torno de seis semanas de pesquisa. Sudmann e Bang(37) mostraram inibição da remodelação haversiana em coelhos utilizando indometacina. No atual estudo, embora tenhamos observado remodelação do calo nos animais do grupo controle, não continuamos a pesquisa além de seis semanas, o que inviabilizou possível análise da remodelação nos grupos que usaram AINEs, Ape-sar disso, outros autores não demonstraram ação das dro-gas AINEs durante essa fase(8,35).
Uma fraqueza do nosso experimento foi a ausência de estudos radiográfico e mecânico do calo. A maioria dos autores concorda que a análise mecânica do calo é a melhor forma de avaliação do processo de consolidação de fratura(38,39). No entanto, não pudemos realizá-la por razões de ordem econômica. Por outro lado, optamos por não utilizar estudo radiográfico, pois Giordano(12) demonstrou ser esse exame impreciso na avaliação do calo ósseo em fraturas não imobilizadas de tíbias de ratos.
Um dos animais do grupo 1 (tenoxicam) evoluiu com aspecto histológico de pseudartrose após quatro semanas de pesquisa. Mobilidade excessiva, potencialmente causa-da pela não fixação da fratura, tem sido associada à formação de um calo cartilaginoso(40). No entanto, isso não nos parece provável, uma vez que diversos estudos utilizando esse mesmo modelo de pesquisa vêm demonstrando que ocorre consolidação óssea após 28 dias de fratura(1,12,13,14,20, 41,42,43,44). Recentemente, Le et al(45) estudaram os aspectos moleculares da osteogênese em fraturas fixadas e não fixadas de tíbias de ratos. Esses autores observaram influência mecânica durante a regulação da formação dos tecidos cartilaginoso e ósseo; apesar disso, não houve diferenças histológicas e moleculares no calo entre os dois grupos analisados ao término de quatro semanas de pesquisa.
CONCLUSÃO
Sob as condições estudadas, os autores concluem que as drogas AINEs utilizadas retardam, mas não impedem, a consolidação de fratura em tíbias de ratos. Baseado nos achados do grupo controle ao término de seis semanas de experimento, esse atraso demonstrou ser de aproximadamente duas semanas.
1. Giordano Neto V.: Influência do Tenoxicam no Processo de Consolidação de Fratura. Estudo Experimental em Tíbia de Ratos [Dissertação de Mestrado]. Rio de Janeiro: Programa de Pós-Graduação em Ortopedia e Traumatologia, Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999.
2. Altman R.D., Latta L.L., Keer R., et al: Effect of nonsteroidal antiin- flammatory drugs on fracture healing: a laboratory study in rats. J Or- thop Trauma 9: 392-400, 1995.
3. Törnkvist H., Bauer F.C.H., Nilsson O.S.: Influence of indomethacin on experimental bone metabolism in rats. Clin Orthop 193: 264-270, 1985.
4. Giordano V., Giordano M., Knackfuss I.G.: Fatores de crescimento e diferenciação ósseos. Presente e futuro. RBM 57: 1018-1029, 2000.
5. Pilbeam C.C., Fall P.M., Alander C.B., et al: Differential effects of non- steroidal antiinflammatory drugs on constitutive and inducible prostag- landin G/H synthase in cultured bone cells. J Bone Miner Res 12: 1198- 1203, 1997.
6. Kawaguchi H., Pilbeam C.C., Harrison J.R., et al: The role of prostag- landins in the regulation of bone metabolism. Clin Orthop 313: 36-46, 1995.
7. Klein D.C., Raisz L.G.: Prostaglandins: stimulation of bone resorption in tissue culture. Endocrinology 86: 1436-1440, 1970.
8. Keller J., Kjærsgaard-Andersen P., Bayer-Kristensen I., et al: Indometha- cin and bone trauma. Effects on remodeling of rabbit bone. Acta Orthop Scand 61: 66-69, 1990.
9. Barner A.: Review of clinical trials and benefit/risk ratio of meloxicam. Scand J Rheumatol 25 (Suppl 102): 29-37, 1996.
10. Distel M., Mueller C., Bluhmki E., et al: Safety of meloxicam: a global analysis of clinical trials. Br J Rheumatol 35 (Suppl 1): 68-77, 1996.
11. Bonnarens F., Einhorn T.A.: Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Orthop Res 2: 97-101, 1984.
12. Giordano M.: Influência de Drogas Anticoagulantes no Processo de Consolidação de Fratura de Tíbia. Estudo Experimental em Ratos. [Dissertação de Mestrado]. Rio de Janeiro: Programa de Pós-Graduação em Ortopedia e Traumatologia, Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2000.
13. Giordano V., Knackfuss I.G., Gomes R.C., et al: Influência do laser de baixa energia no processo de consolidação de fratura de tíbia: estudo experimental em ratos. Rev Bras Ortop 36: 174-178, 2001.
14. Giordano V., Giordano M., Knackfuss I.G., et al: Influência do tenoxi- cam no processo de consolidação de fratura de tíbia. Estudo experimen- tal em ratos. Rev Bras Ortop 34: 395-400, 1999.
15. Strub K.M., Æppli L., Daum A.: "Anti-inflammatory and analgesic ef- fects of tenoxicam (Tilcotil®) in rats" in Russo-Marie F., et al.: Advances in inflammatory research. New York, Raven Press, 387-390, 1986.
16. Engelhard G., Homma D., Schlegel K., et al: Antiinflammatory, analge- sic, antipyretic, and related properties of meloxicam, a new nonsteroidal antiinflammatory agent with favorable gastrointestinal tolerance. Inflamm Res 44: 423-433, 1995.
17. Close B., Banister K., Baumans V., et al: Recommendations for eutha- nasia of experimental animals: Part 1. Lab Anim 30: 293-316, 1996.
18. Close B., Banister K., Baumans V., et al: Recommendations for eutha- nasia of experimental animals: Part 2. Lab Anim 31: 1-32, 1997.
19. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes [Acessado em 15 de Junho de 2001]. Disponível no site: http://www.uku.fi/laitokset/vkek/Sopimus/ convention.html.
20. Udupa K.N., Prasad G.C.: Chemical and histochemical studies on the organic constituents in fracture repair in rats. J Bone Joint Surg [Br] 45: 770-779, 1963.
21. Bancroft J.D., Cook H.C.: Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application. New York, Churchill/Livingstone, 1994.
22. Allen H.L., Wase A., Bear W.T.: Indomethacin and aspirin: effect of nonsteroidal antiinflammatory agents on the rate of fracture repair in rat. Acta Orthop Scand 51: 595-600, 1980.
23. Knapp R.G., Miller III M.C.: Clinical Epidemiology and Biostatistics. Baltimore, Williams & Wilkins, 1992.
24. Niemcryk S.J., Kraus T.J., Mallory T.H.: Empirical considerations in orthopaedic research design and data analysis. Part II: The application of data analytic techniques. J Arthroplasty 5: 105-115, 1990.
25. Niemcryk S.J., Kraus T.J., Mallory T.H.: Empirical considerations in orthopaedic research design and data analysis. Part I: Strategies in re- search design. J Arthroplasty 5: 97-103, 1990.
26. Anderson G.D., Hauser S.D., McGarity K.L., et al: Selective inhibition of cyclooxigenase (COX)-2 reverses inflammation and expression of COX-2 and interleukin 6 in rat adjuvant arthritis. J Clin Invest 97: 2672- 2679, 1996.
27. Crofford L.J.: COX-1 and COX-2 tissue expression: implications and predictions. J Rheumatol (Suppl 49) 24: 15-19, 1997.
28. Seibert K., Zhang Y., Leahy K., et al: Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proc Natl Acad Sci 91: 12013-12017, 1994.
29. Faraj M., Rabelo H.C., Gontijo M.B.: Tópicos atuais sobre o uso dos antiinflamatórios não-esteróides na clínica. JBM 73: 57-69, 1997.
30. Elves M.W., Bayle I., Roylance P.J.: The effect of indomethacin upon experimental fractures in the rat. Acta Orthop Scand 53: 35-41, 1982.
31. Keller J., Bayer-Kristensen I., Bak B., et al: Indomethacin and bone re- modeling. Effect on cortical bone after osteotomy in rabbits. Acta Or- thop Scand 60: 119-121, 1989.
32. Sudmann E., Dregelid E., Bessesen A., et al: Inhibition of fracture heal- ing by indomethacin in rats. Eur J Clin Invest 9: 333-339, 1979.
33. Elmstedt E., Lindholm T.S., Nilsson O.S., et al: Effect of ibuprofen on heterotopic ossification after replacement. Acta Orthop Scand 56: 25- 27, 1985.
34. McLaren A.C.: Prophylaxis with indomethacin for heterotopic bone af- ter open reduction of fractures of the acetabulum. J Bone Joint Surg [Am] 72: 245-247, 1990.
35. Schmidt S.A., Kjaersgaard-Andersen P., Pedersen N.W., et al: The use of indomethacin to prevent the formation of heterotopic bone after total hip replacement. A randomized, double-blind clinical trial. J Bone Joint Surg [Am] 70: 834-838, 1988.
36. Leunig M., Yuan F., Gerweck L.E., et al: Quantitative analysis of angio- genesis and growth of bone: effect of indomethacin exposure in a com- bined in vitro-in vivo approach. Res Exp Med (Berl) 195: 275-288, 1995.
37. Sudmann E., Bang G.: Indomethacin-induced inhibition of haversian re- modeling in rabbits. Acta Orthop Scand 50: 621-627, 1979.
38. Delgado-Martinez A.D., Martinez M.E., Carrascal M.T., et al: Effect of 25-OH-vitamin D on fracture healing in elderly rats. J Orthop Res 16: 650-653, 1998.
39. Ekeland A., Engesæter L.B., Langeland N.: Mechanical properties of fractures and intact rat femora evaluated by bending, torsional and tensile tests. Acta Orthop Scand 52: 605-613, 1981.
40. Buckwalter J.A.: Effects of early motion on healing of musculoskeletal tissues. Hand Clin 12: 13-24, 1996.
41. Duthie R.B., Barker A.N.: The histochemistry of the preosseous stage of bone repair studied by autoradiography. The effect of cortisone. J Bone Joint Surg [Br] 37:691-710, 1955.
42. Mendes P.H.B., Scofano Junior A.R., Silva M.G., et al: Consolidação da fratura após o uso prolongado de corticóide: estudo experimental em ratos. Rev Bras Ortop 36: 345-351, 2001.
43. Pentinnen R.: Biochemical studies on fracture healing in the rat with special reference to the oxygen supply. Acta Chir Scand (Suppl 432): 1- 32, 1970.
44. Wray J.B., Lynch C.J.: The vascular response to fracture of the tibia in the rat. J Bone Joint Surg [Am] 41: 1143-1148, 1959.
45. Le A.X., Miclau T., Hu D., et al: Molecular aspects of healing in stabilized and non-stabilized fractures. J Orthop Res 19: 78-84, 2001.
