Iniciamos então uma primeira série de experiências, em coelhos, procurando observar, através da fluorescência, a passagem da tetraciclina por via placentária.
Depois de constatar pelo exame da literatura que a passagem transplacentária já era conhecida de vários autores, decidimos experimentar algumas vias de introdução da tetraciclina, ainda não exploradas, pois na grande maioria dos trabalhos, os autores limitaram-se a utilizar as vias oral, endovenosa e intraperitoneal.
Tendo presente estes preliminares resolvemos, numa segunda série de experiências, testar três novas vias de introdução para a tetraciclina, a saber:
1. percutânea, em ratos recém-nascidos
2. intra-articular, em cães adultos
3. uma nova modalidade de via oral através do aleitamento após ingestão de tetraciclina pela rata-mãe.
LITERATURA
A clor-tetraciclina foi descoberta em 1948 por Duggar. Modificações químicas da clor-tetraciclina produziram a tetraciclina (Tetrex), a oxi-tetraciclina (Terramicina), a dimetil-clor-tetraciclina (Ledermicina) e a N-pirrolidino-metil-tetraciclina (Tetrin).
As tetraciclinas fluorescem à luz ultravioleta e esta propriedade foi utilizada na investigação da sua distribuição em vários tecidos do organismo por Helander e Böttiger (1953)(3) e Böttiger (1955a e 1955b)(4,5), que verificaram uma fluorescência amarelo-brilhante, persistente no sistema reticuloendotelial e nos tecidos moles de camundongos tratados com tetraciclina. Estes autores não pesquisaram a localização da tetraciclina no osso. André (1956)(6) ao empregar a auto-radiografia para detectar a presença de tetraciclina marcada pelo tritio, nos tecidos do gato e do camundongo, verificou que a radioatividade persistia nos ossos e dentes de animais adultos e também nos de fetos.
A fluorescência da tetraciclina no osso foi descrita pela primeira vez por Rall, Loo, Lane e Kelly (1957)(1), os quais durante uma investigação de tumores malignos, à luz ultravioleta, observaram fluorescência amarela no tecido tumoral e no osso adjacente, de um paciente que tinha previamente recebido tetraciclina. Em ulterior experiência, no camundongo, repararam que a fluorescência persistia no osso até 10 semanas depois da injeção de tetraciclina.
A localização específica da tetraciclina no osso foi estudada em vários animais de experimentação por Milch, Rall e Toble (1958, 1958)(7,8). Em animais em fase de crescimento, uma fluorescência amarela foi notada no osso esponjoso, no periósteo, no endósteo, nos osteônios do osso compacto e no tecido ósseo reacional. Os experimentos revelaram ser menos de 1/10 da dose terapêutica, a quantidade de droga necessária para produzir a fluorescência. Estudos microscópios de preparações não descalcificadas (a fluorescência é removida pela descalcificação), mostraram que no osso lamelar a fluorescência se apresentava como uma linha paralela à superfície em crescimento, enquanto que no ossos entrelaçado (calo ósseo) e no osteossarcoma a fluorescência era difusa. Mc Leay (1958)(9) e Mc Leay e Walske (1960)(2) acharam que a fluorescência da tetraciclina poderia vir a ser método útil na detecção de metástases ósseas durante a cirurgia.
A localização precisa da tetraciclina no osso lamelar foi investigada por Ghosez (1959)(10), que tratou um cão jovem com tetraciclina intravenosa, sacrificando-o depois de 18 horas. A fluorescência da tetraciclina fixava-se no front de calcificação do tecido osteóide e nas superfícies em crescimento e não no osso em repouso.
Esta observação foi confirmada por Ponlot (1960)(11).
Harris (1960)(12) por meio de injeções intravenosas de tetraciclina, aplicadas em cães a intervalos de tempo conhecidos, mostrou que a droga, inicialmente depositada na linha de calcificação, era incorporada ao osso pelo crescimento oposicional na parte óssea superficial. O osso formado no intervalo entre as doses, ficava circunscrito por linhas de tetraciclina que mediam menos de 8 micra de largura. Harris concluiu que as tetraciclinas podiam ser usadas para medida microscópica quantitativa do crescimento oposicional.
Harris, Jowsey e Jackson (1962)(13) compararam em cães a distribuição da tetraciclina com a impregnação de cálcio radioativo (Ca45).
Acharam que além dos osteônios contendo faixas de tetraciclina, esta em outros pontos se comportava como o cálcio e era incorporada por difusão em osteônios sofrendo mineralização secundária; fluorescência fraca foi observada no osso intersticial e na borda do tecido envolvendo os osteócitos. Achados similares foram relatados por Urist, Zaccalini, MacDonald e Skoog(1962)(14) no osso humano.
A observação de Milch (1958)(8) de que a impregnação de tetraciclina no osso trabecular era difusa foi confirmada por Muzii (1960,1961)(15,16) no esqueleto do cão jovem e por Muzii e Caravita (1961)(17) no osso do sapo. Este fenômeno não foi satisfatoriamente explicado.
Sedlin e Frost (1962)(18) conseguiram demonstrar, através da fluorescência, a administração pregressa do antibiótico em períodos anteriores da vida de um grupo de indivíduos.
Baud e Dupont, em 1962(19), descreveram, em material altamente orientado, bifluorescência do tecido ósseo tratado pela tetraciclina. A constatação desta fluorescência polarizada permite concluir que as moléculas de tetraciclina fixadas à substância óssea estão dispostas paralelamente entre elas e orientadas regularmente em relação à textura inframicroscópica do osso.
Lee (1963)(20), numa extensa tese, analisa a estrutura e o crescimento aposicional do osso, a remodelação do osso através de radioisótopos e de corantes intravitais, focalizando em particular as tetraciclinas. Examina ainda a tetraciclina como marcador microscópico em estudo quantitativo da formação óssea. Prosseguindo, Lee (1964)(21) compara as velocidades de crescimento aposicional, em seções de osso não descalcificado do cão, usando um micrômetro calibrado montado na ocular para medir as distâncias lineares entre duas marcas. Foi grande a variação da distância entre as marcas nos diferentes osteônios. A média de crescimento aposicional no cão jovem foi cerca de 2 micra por dia e no cão velho de 1 mícron por dia.
Delzu (1963)(22) estuda, na câmara anterior do olho do rato, a fluorescência captada pelo enxerto ósseo.
Conforti (1964)(23) injetou tetraciclinas de fluorescências diferentes para estudar, em ratos de idade diversa e a períodos de intervalo variáveis, o encurtamento dos parietais.
A natureza exata do complexo formado pelo fluorocromo tetraciclina-osso não é conhecida.
Albert (1953)(24) e Albert e Reese (1956)(25) demonstraram que as tetraciclinas formam complexos com os íons metálicos.
Kohn (1961)(26) mostrou que as tetraciclinas ligam-se a macromoléculas somente na presença de íons metálicos.
O fluorocromo extraído pela técnica de descalcificação do osso é estruturalmente idêntico à tetraciclina [Titus, 1957(27)] e tem atividade antibacteriana, in vitro, por vários dias [Anderson, 1959(28); Plaza-Roca, 1959(29)].
Finermann e Milch (1963)(30) estudaram a combinação das tetraciclinas com o cálcio in vitro.
Ibsen e Urist (1964)(31) fizeram extensa revisão da bioquímica e do mecanismo de ação das tetraciclinas, com especial referência aos tecidos mineralizados e à fluorescência. Estudaram as várias hipóteses explicativas do modus de incorporação da tetraciclina ao osso.
Steendijk (1964)(32) utilizando ratos normais e raquíticos procurou demonstrar que a fixação das tetraciclinas no osso ocorre por um processo de absorção. A droga permanece fixada nos sítios de deposição óssea porque é coberta por novos depósitos de osso. Desta maneira elas são incorporadas ao osso e não podem ser removidas. A deposição das tetraciclinas ocorre principalmente na superfície, mas uma distribuição difusa adicional pode ser encontrada em osso incompletamente mineralizado.
O fato de ser a tetraciclina incorporada ao osso, de modo duradouro, despertou uma série de estudos para a verificação de uma possível toxicidade.
A tetraciclina cruza a barreira placentária e é incorporada ao esqueleto do feto [André, 1956(6)].
Filippi e Mela (1957, 1958)(33,34) relataram, em trabalhos de conclusões discutíveis, vários tipos de anomalias do desenvolvimento, tais como fenda palatina, sindactilia, hipoplasia mandibular e encurtamento dos membros, em conceptos de ratas grávidas, tratadas com tetraciclina, durante a gestação. Nestes trabalhos os autores levantaram a hipótese de que os efeitos teratogênicos poderiam ser conseqüentes à deficiência em complexo vitamínico B, produzida secundariamente pelas tetraciclinas administradas por via oral.
Bevelander, Nakahara e Rolle (1959)(35) induziram deformidades esqueléticas em embriões de galinha, introduzindo grandes doses de tetraciclina no saco vitelino e usa-ram a coloração de Von Kossa para demonstrar que os ossos estavam incompletamente desenvolvidos, apresentando número reduzido de trabéculas, com mineralização inferior a 50% do normal, periósteo espessado, interrupção no desenvolvimento do tecido hematopoiético e condrogênese retardada. Por outro lado, Rolle, Bevelander e Fisher (1962)(36) não conseguiram reproduzir aquelas deformidades na descendência de galinhas alimentadas com uma dieta contendo doses terapêuticas de tetraciclina.
Bevelander, Goldberg e Nakahara (1960)(37) verificaram que a ação inibidora da tetraciclina se exerce na época da diferenciação do esqueleto, em estudos feitos em larvas de invertebrados marinhos.
Harris (1960)(12) observou que a mineralização do osso lamelar do cão adulto era inibida por altas doses de tetraciclina.
Buyske, Eisner e Kelly (1960)(38), em ratos adultos, após tratamento demorado com diversas tetraciclinas, não encontraram alteração patológica no tecido ósseo.
Bevelander, Rolle, Cohlan (1961)(39) e Hurley e Tuch-mann-Duplessis (1963)(40) descreveram retardo no crescimento de ratos tratados com tetraciclina.
Atraso no desenvolvimento do esqueleto humano, causado pela tetraciclina, foi relatado por Cohlan, Bevelander e Bross (1961)(41) e por Cohlan, Bevelander e Tiamsic (1963)(42).
Carter e Wilson (1962 e 1963)(43,44) referem um caso de anomalia congênita de extremidade, em feto, possivelmente relacionada com tratamento pela tetraciclina durante o período de gestação. Discutem a ação da tetraciclina e da penicilina na teratogênese, julgando inconclusivos os dados atuais sobre o problema e preconizando novas e urgentes pesquisas neste campo.
Bevelander, Rolle e Cohlan (1961)(39) mostraram defeitos na mineralização de dentes de ratos tratados com tetraciclina. Wallman e Hilton (1962)(45) verificaram alterações do esmalte dental de crianças que se submeteram a tratamento com antibióticos do grupo das tetraciclinas. Har-court, Johnson e Storey (1962)(46), estudando dentes decíduos e permanentes de crianças que tomaram tetraciclina na época da odontogênese, por causa de doenças infecciosas sistêmicas, encontraram coloração amarela nos dentes e alterações na dentino-gênese; atribuíram tais alterações a doenças sistêmicas e não às tetraciclinas.
Boyne e Kruger (1962)(47) relataram retardo na regeneração óssea do alvéolo dental do cão ao implantar cones de tetraciclina no local, após exodontia.
Haddad et al (1964)(48) não verificaram retardo na ossificação de cavidade alveolar após extração dental, em ratos adultos, tratados pela tetraciclina por via intramuscular. Estudando a osteogênese no processo de reparo de fraturas provocadas em ossos longos, de ratos adultos tratados por tetraciclina, não encontraram qualquer alteração na neoformação óssea.
SÚMULA DA LITERATURA
Da análise da literatura nota-se que os autores se repartem em dois grupos:
1. os que utilizando-se, em particular, da fluorescência da tetraciclina estudaram: o crescimento ósseo e sua medida; as vias de penetração da tetraciclina; a forma pela qual o osso retém a tetraciclina; a polarização da fluorescência; a identificação e delimitação de neoplasmas; a excreção e os efeitos metabólicos da tetraciclina etc.;
2. os que procuraram verificar a toxicidade das tetraciclinas, seja em animais, seja em embriões e prematuros, seja nas crianças e adultos.
Embora uma certa toxidez pudesse ser prevista da estrutura quinoide policíclica das tetraciclinas, já experiência mostra que, doses orais diárias de 30mgrs/kilo de peso são bem toleradas por adultos com aparelho excretor íntegro. A inocuidade da referida substância, em casos como tais, é inoperante para contestar observações de intoxicação, como a representada pela coloração amarela irreversível dos dentes de crianças às quais foi administrada tetraciclina.
Ainda em relação a toxicidade da tetraciclina vários autores demonstraram alterações congênitas graves em animais de experimentação, revelando um efeito teratogênico, que deve alertar clínicos, obstetras, pediatras e ortopedistas, para uma aplicação mais cuidadosa da droga, quando for o caso de embrião em formação, prematuro ou paciente com doença renal.
MATERIAL E MÉTODO
Foram estudados ao todo, entre tratados e controles, 34 animais assim repartidos:
a) quatro coelhos recém-nascidos, cujas mães receberam injeção intraperitoneal de tetraciclina.
Via transplacentária.
b) três ratos recém-nascidos submetidos a banho de tetraciclina.
Via percutânea.
c) dois cães adultos que receberam tetraciclina injetada.
Via intra-articular.
d) oito ratos recém-nascidos, cujas mães tomaram ma-madeira de tetraciclina.
Via oral através de aleitamento.
e) três ratos recém-nascidos que tomaram tetraciclina por via oral direta.
Testemunho quantitativo.
f) 13 ratos recém-nascidos que não tomaram tetraciclina.
Controles.
g) um cão adulto que não tomou tetraciclina.
Controle.
Grupo A - Via transplacentária
Coelhos recém-nascidos
ninhada no 1: seis filhotes
ninhada no 2: cinco filhotes
Foram utilizadas duas coelhas pesando, respectivamente, 3.600 e 3.700 gramas, procedentes do biotério geral. Aos 22 e 23 dias de gestação foram injetados, intraperitonealmente, 10mg de tetraciclina (Tetrex) por quilo de peso, durante seis dias consecutivos, suspendendo-se a seguir a medicação. Duas crias de cada coelha-mãe foram sacrificadas, um, dois, três e 17 dias depois do nascimento.
Após evisceração e retirada das partes moles, o esqueleto foi observado, macroscopicamente, por lâmpada de Wood, em câmara escura. Estes exames foram repetidos, diariamente, durante a primeira semana e depois, semanalmente, durante três meses. As peças foram mantidas à luz e temperatura ambiente.
Várias tentativas feitas para documentar os achados com fotografia colorida foram mal sucedidas.
Grupo B - Via percutânea
Ratos recém-nascidos
ninhada no 1: seis filhotes
Três dos seis filhotes desta ninhada, separados da mãe a partir do segundo dia de nascimento, foram aprisionados em pequenas caixas de papelão, de modo a terem as cabeças apreendidas através de orifício praticado na caixa e o corpo no interior da mesma; nesta posição foram mantidos por 48 horas, com o corpo envolvido em mechas de algodão embebido em suspensão de tetraciclina. O aprisionamento descrito foi necessário porque em outras tentativas os filhotes lamberam-se uns ao outros inutilizando a experiência. Ao cabo daquele tempo, foram sacrificados, junta-mente com os outros três não tratados e que constituíram testemunhos. Após o sacrifício foram preparados para estudo histológico, conforme técnica descrita no final deste capítulo.
Grupo C - Via intra-articular
Cães adultos
Em dois cães, no 1 e no 2, foram praticadas injeções in-tra-articulares, nos joelhos, segundo a técnica de Machado (1963)(49).
O cão no 1, preto, com 10kg de peso, recebeu injeções intra-articulares de 15mgrs de N-pirrolidino metil-tetraci-clina (Tetrin) em ambos os joelhos, em dias alternados. Recebeu ao todo 12 injeções, perfazendo um total de 180mg. Após sete e 11 dias de experiência, foram feitas biópsias, respectivamente, do processo espinhoso de uma vértebra lombar e de um metatarsiano.
O cão no 2, branco, com 7kg de peso, recebeu injeções intra-articulares de 30mgrs de N-pirrolidino metil-tetraci-clina, em dias seguidos, em joelhos alternados. Recebeu ao todo oito injeções perfazendo um total de 240mg. Após quatro e 11 dias de experiência, foram praticadas biópsias, respectivamente, do processo espinhoso de vértebra lombar e de um metatarsiano.
Em ambos os casos o material colhido foi tratado pela técnica de desgaste para osso não descalcificado. A seguir foram levados a exame direto, por microscopia de fluorescência.
Grupo D - Via oral através de aleitamento
Ratos recém-nascidos
ninhada no 2: oito filhotes
ninhada no 3: seis filhotes
As ratas mães, desde o dia do parto, tomaram tetraciclina (Tetrex) por via oral, suspensa na água das mamadeiras, numa dose diária de cerca de 100mg por quilo de peso corporal. A mãe da ninhada no 2 recebeu o tratamento por 30 dias consecutivos e a da ninhada no 3, por 10 dias. Seus filhotes foram mantidos em aleitamento natural. Das duas ninhadas foram sacrificados filhotes de um, dois, sete e oito dias de idade. Os demais filhotes foram preservados para estudos ulteriores. Após sacrifício foram preparados para exame histológico conforme técnica descrita no final do capítulo.
Grupo E - Via oral direta - testemunho quantitativo
Ratos recém-nascidos
ninhada no 4: sete filhotes
Três dos sete filhotes tomaram "per os", durante três dias consecutivos, três doses diárias de suspensão de tetraciclina, por meio de instilações, diretamente no esôfago, usando pipeta especial, numa dose total de aproximadamente 4mg de tetraciclina; este tratamento foi instituído em ratos de três dias de idade. Os animais assim tratados continua-ram a mamar normalmente na mãe. Ao fim do terceiro dia de tratamento foram sacrificados, juntamente com os quatro filhotes restantes (controles). Este grupo tratado diretamente "per os" teve como finalidade, não só testemunhar a incorporação óssea de tetraciclina, empregada no trabalho, como servir de padrão para possíveis comparações quantitativas da intensidade da fluorescência.
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Nos grupos B, D e E, após sacrifício por sangria, foi a seguinte a técnica de preparação: evisceração e exposição do esqueleto, sendo o material fixado em formol a 10%, tamponado a Ph 7 (tampão fosfato). Após 24-48 horas de fixação, foram colhidos fragmentos dos membros inferiores e da coluna dorsal e lombar e este material submetido a cortes por congelação, a 20ºC, em criostato ("Harris"), obtendo-se cortes de tecido ósseo não descalcificado, numa espessura padronizada de 12 micra. Tais cortes, colhidos em lâminas de quartzo, próprias para microscopia de fluorescência, foram mantidos ao natural, sem qualquer coloração ulterior.
O exame foi praticado com microscópio "Binolux" da marca "Reichert®" cuja fonte de irradiação ultravioleta se constitui de um bulbo de vapor de mercúrio a alta pressão. Para facilitar o exame comparativo, em cada lâmina foram colhidos cortes de animais tratados juntamente com os dos controles correspondentes.
RESULTADOS
Grupo A - Via transplacentária
Em todos os conceptos o esqueleto e os dentes mostraram fluorescência amarelo-ouro, ao exame macroscópico. A zona mais intensamente fluorescente era o crânio. Estavam isentos de fluorescência amarela as zonas cartilaginosas e articulares, que mostravam apenas autofluorescência violeta pálido, semelhante a de outros tecidos moles.
A fluorescência persistiu praticamente imutável nas duas primeiras semanas; foi esmaecendo com o correr do tempo para desaparecer depois de três meses.
Grupo B - Via percutânea
Do material para estudo foram selecionados campos histológicos de centros de ossificação vertebral e da zona metáfiso-epifisária tibial e femoral. Estes mesmos campos submetidos à irradiação ultravioleta evidenciaram fluorescência amarelo-ouro nas regiões de osso neoformado do centro de ossificação e nas regiões cortical e medular das zonas metáfiso-epifisárias.
A intensidade da fluorescência era maior nas zonas de ossificação mais recente - mais ativa - do que no osso já formado, menos ativo (figs. 1 a 6).
A fluorescência era mais intensa nas zonas mais densamente calcificadas do que na matriz osteóide.
As zonas cartilaginosas vizinhas não mostraram fluorescência amarelo-ouro, apresentando apenas uma autofluorescência levemente esverdeada, semelhante a dos tecidos moles adjacentes.
Grupo C - Via intra-articular
Verificou-se que o material era constituído por osso adulto cortical e esponjoso.
À irradiação ultravioleta, apareciam faixas de fluorescência amarela na orla das trabéculas do tecido esponjoso e no osso que envolvia as lacunas maiores do osso compacto.
O osso compacto mais antigo apresentava uma autofluorescência esverdeada que fazia contraste com a precedentemente descrita (cão no 1).
No cão no 2, a distribuição da fluorescência amarela era irregular, observando-se manchas isoladas e áreas de fluorescência difusa.
Grupo D - Via oral - através de aleitamento
Os achados deste grupo superpõem-se aos do grupo B. Vinte e quatro horas de aleitamento foram suficientes para evidenciar a fluorescência.
Não se notaram diferenças nítidas, quanto à intensidade de fluorescência, entre os animais tratados.
Grupo E - Via oral direta - testemunho quantitativo
Neste grupo a fluorescência amarelo-ouro foi nitidamente mais intensa do que a verificada nos grupos B e D.
Quanto aos outros aspectos, as imagens eram superponíveis.
Os controles não apresentaram fluorescência.
DISCUSSÃO-CONCLUSÕES
As nossas experiências vieram por um lado confirmar dados fornecidos por outros autores, como, por exemplo, a comprovação de que a fluorescência amarela é mais intensa no crânio do que nas outras partes do esqueleto, poupando as cartilagens não calcificadas (grupo A).
Por outro lado, realizamos verificações originais (grupos B, C e D), quais sejam, a constatação da fluorescência amarela, alcançada através das três vias escolhidas, a saber: percutânea, intra-articular e através do aleitamento.
Tais vias de administração poderiam teoricamente criar influências metabólicas que dificultassem a passagem da tetraciclina ou alterassem a sua composição físico-quími-ca, o que seria traduzido por absorção de quantidades insuficientes para produzir fluorescência óssea. As várias camadas do tegumento não são órgãos ideais para a absorção de substâncias e poder-se-ia supor que a tetraciclina não passasse através dele em quantidade suficiente para impregnar o osso. A membrana hemato-sinovial é sabidamente permeável a um grande número de substâncias, mas a dissolução da tetraciclina no líquido sinovial, poderia se fazer de tal sorte a possibilitar apenas a passagem de quantidades infinitesimais da droga, insuficientes para revelarem fluorescência óssea. No caso do aleitamento seria possível que a tetraciclina, embora atingindo o leite materno o fizesse em concentração mínima, incapaz de induzir fluorescência óssea. Ora, os nossos grupos B, C e D demonstraram que tais hipóteses não foram confirmadas e que nas condições da presente pesquisa, apesar das limitações acima expostas, a quantidade de tetraciclina absorvida foi suficiente para induzir fluorescência óssea.
Em particular, o experimento do grupo D vem demonstrar que já nas primeiras 24 horas de aleitamento foi constatada a passagem de tetraciclina para o osso, detectada pela fluorescência do esqueleto do animal lactante.
Podemos concluir que além das vias de introdução da tetraciclina já conhecidas da literatura médica (oral, intramuscular, endovenosa, transplacentária, ocular, subcutânea e retal [Maynard, 1954(50)], as outras três vias por nós pesquisadas (percutânea, intra-articular e através de aleitamento) também induzem fluorescência óssea. Deste modo confirmamos a assertiva de que independe da via de administração a passagem de tetraciclina e ulterior incorporação óssea.
Comparando-se áreas de tecido ósseo observou-se que a intensidade da fluorescência é maior nas zonas de osteogênese e de osso neoformado do que no tecido ósseo mais antigo, o que deve ser explicado como propõe Urist(14) pela maior reatividade química, maior vascularização, menor tamanho dos cristais da superfície, maior hidratação e um arranjo mais frouxo dos constituintes orgânico e inorgânico da matriz.
A fluorescência da tetraciclina tem sido importante arma para estudo da dinâmica do osso e para investigações oncológicas, mas as possibilidades de pesquisa devem ser alargadas para trabalhos que envolvam outros aspectos da neoprodução óssea, como sejam: fraturas, pseudartroses, doença de Paget etc. e também para condições patológicas resultantes de retardo de formação óssea como necrose óssea infecciosa, necrose óssea avascular, doenças degenerativas etc.
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