A perda de um tecido ou parte dele leva o organismo a tentar substituí-lo da melhor maneira e, se possível, com um semelhante ao original. O tecido ósseo apresenta grande potencial de regeneração; entretanto, em casos de perda extensa devido a traumas, tumores, infecções, etc., isso não acontece. Nesses casos, uma excelente alternativa de tratamento seria a utilização de enxerto autógeno. Porém, a necessidade de internação, segunda intervenção cirúrgica, maior período de convalescença, suscetibilidade a infecções no sítio doador, reabsorção progressiva e constante se constituíram em inconvenientes importantes que levaram à procura de um substituto eficiente para esse tipo de enxerto. O material ósseo-substituto ideal deve aliar biocompatibilidade, previsibilidade, aplicação clínica, ausência de riscos transoperatórios e seqüelas pós-operatórias mínimas, além de aceitação por parte do paciente. Apesar de ainda não existir um material que preencha todos esses requisitos, uma grande variedade de opções de materiais para enxertos ósseos foi desenvolvida, associada aos avanços no conhecimento e tecnológicos nessa área.
Nas duas últimas décadas, a reconstrução esquelética obteve um salto tecnológico significativo com a descoberta e o estudo de fatores de indução da formação óssea e de seus sistemas de carreamento(1,2,3,4,5). O papel de carreador dos fatores de indução óssea potencialmente pode ser desempenhado pelo osso mineral bovino cortical ou medular, macro ou microgranular, desproteinizado, como já foi demonstrado em estudos clínicos(6). Além de fornecer uma estrutura de suporte e para a osteocondução, podem disponibilizar íons cálcio e fosfato, essenciais para o neoformação do tecido ósseo(7,8). Embora existam muitos estudos sobre esses novos biomateriais, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na resposta tecidual a esses materiais ainda não estão totalmente esclarecidos.
No presente trabalho, avaliamos a resposta tecidual frente a dois tipos de osso mineral macrogranular preparado com cortical óssea bovina, um desproteinizado a 100°C (produzido no laboratório de Bioquímica da FOB-USP) e outro a 1.000°C (Gen-Ox®, Baumer S.A.), implantados em tecido subcutâneo de ratos. A biocompatibilidade foi verificada pela análise histológica e bioquímica através da atividade específica da fosfatase ácida de alta massa molecular relativa (um marcador lisossomal) e da fosfotirosina proteína fosfatase, uma das enzimas responsáveis pelo controle do processo de proliferação e diferenciação celular(9). Os resultados histológicos e bioquímicos nos permitiram concluir que os dois materiais testados são biocompatíveis e potenciais carreadores de proteínas e células na engenharia de tecidos.
MATERIAL E MÉTODOS
O total de 60 ratos albinos da linhagem Wistar, machos adultos (160g), provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru - USP, foram utilizados. Todos os animais foram mantidos durante todo o período do experimento com ração peletada Purina e água ad libitum.
Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos de 20 ratos.
Grupo I: controle, implantação subcutânea de cápsulas de colágeno vazias;
Grupo II-100: implantação de partículas de osso cortical bovino macrogranular (1.000-2.000µm), desproteinizadas a 100°C (produzidas no nosso laboratório) e armazenadas em cápsulas de colágeno;
Grupo III-1000: implantação de partículas de osso cortical bovino macrogranular (1.000-2.000µm), desproteinizadas a 1.000°C (Gen-Ox®, Baumer S.A., Registro MS no 103.455.00001) e armazenadas em cápsulas de colágeno.
Preparo dos animais e procedimentos cirúrgicos de implantação
Cada animal foi anestesiado por inalação de éter etílico, sendo mantido neste estado por todo o período operatório. Após tricotomia e a assepsia de sua região dorsal com gaze embebida em álcool iodado, uma incisão reta de 3cm, com lâmina de bisturi no 10, foi realizada no sentido craniocaudal, expondo o tecido conjuntivo subcutâneo. A divulsão do tecido conjuntivo foi realizada à direita e à esquerda da linha craniocaudal suficientemente distante para a acomodação de duas cápsulas, uma para análise histológica e outra para a bioquímica. A seguir, os retalhos foram suturados com fio de seda 4.0 e a região submetida a nova anti-sepsia com álcool iodado. As suturas descontínuas aplicadas foram removidas após uma semana.
Obtenção das biópsias e processamento histotécnico
Decorridos os períodos experimentais de 10, 20, 30 e 60 dias, cinco ratos de cada grupo, por período, foram sacrificados com dose excessiva de éter etílico e as peças cirúrgicas das duas regiões que receberam os implantes foram removidas, sendo uma direcionada para a análise histológica e a outra para a bioquímica. A peça para a análise histológica foi fixada em formol a 10% em tampão fosfato por uma semana, lavada por uma noite em água corrente, desidratada em etanol, clarificada em xilol e incluída em Histosec Merck (parafina + resina plástica). Cortes alternados de 5µm foram obtidos no micrótomo Jung-Leica e corados pela hematoxilina e eosina.
Determinação da atividade enzimática
A outra peça removida de cada animal foi utilizada para a análise bioquímica como descrito anteriormente por Granjeiro et al(9,10) (1997); e Buzalaf et al(11) (1998). Resumidamente, o extrato límpido de cada uma das biópsias removidas foi utilizado para determinação de atividade da fosfatase ácida total (FAT, sem inibidor), da fosfatase ácida lisossomal (FAL, na presença de p-hidroximercuribenzoato), da fosfatase ácida de baixo peso molecular (FABMr) e da atividade tirosina fosfatase (Tyr-P). Os ensaios foram realizados a 37°C utilizando o p-nitrofenilfosfato como substrato (FAT, FAL, FABMr) ou ti-rosina-fosfato (Tyr-P). Todos os reagentes utilizados foram da marca Sigma Co.
A proteína foi quantificada pelo método de Lowry como descrito anteriormente por Hartree(12) (1972). A atividade especifica (AE) foi determinada como micromol de produto formado por minuto, por miligrama de proteína.
RESULTADOS
A atividade específica de cada enzima foi comparada entre os grupos e entre os períodos experimentais e está resumida na tabela 1.
No grupo controle, a atividade especifica da FAT mantevese constante durante os quatro períodos experimentais (cerca de 17nmol min-1mg-1). A FAL só foi detectada no primeiro e terceiro período e a atividade Tyr-P no segundo e último período.
Nos grupos experimentais II-100 e III-1000, a AE da FAT diminuiu em função do tempo. As atividades das fosfatases e Tyr-P, nos períodos iniciais, foram mais elevadas no grupo II100 que no III-1000, sugerindo uma resposta inflamatória mais acentuada no primeiro. De maneira geral, a AE das fosfatases diminuiu progressivamente, atingindo níveis similares aos do grupo controle.
A resposta tecidual à implantação dos dois materiais (grupo II-100 e grupo III-1000), nos diferentes períodos estudados, foi comparada histologicamente à do grupo controle e os resultados obtidos são resumidos a seguir.
Período de 10 dias
No grupo controle, observamos áreas focais com grande celularidade mostrando células volumosas com material claro no citoplasma, provavelmente macrófagos destruindo a cápsula de colágeno por fagocitose (figura 1A). No grupo II-100 foi observada a presença de um intenso infiltrado inflamatório crônico rico em macrófagos circunscrevendo as partículas implantadas, bem como interagindo com fragmentos da cápsula de colágeno. As imagens das partículas de material eram intensamente eosinofílicas, muito semelhantes às da matriz orgânica óssea (figura 1C). No grupo III-1000, o mesmo infiltrado inflamatório foi observado, porém com um quadro mais moderado e composto de um número maior de células gigantes multinucleadas (CGMIs). Chamava atenção a presença de pontilhado eosinofílico sugestivo de agregados protéicos possivelmente adsorvidos a partir do soro após a implantação do material no tecido subcutâneo (figura 1E).
Periodo de 20 dias
O grupo controle apresentou um infiltrado inflamatório menos intenso, com presença de pequenos focos de macrófagos, semelhante ao do período anterior. O grupo II-100 apresentou um infiltrado inflamatório mais intenso, associado a maior fibrosamento da região. Inúmeros capilares sanguíneos neoformados podiam ser observados entre as partículas implantadas. No gruop III-1000, o aspecto morfológico do tecido caracterizava-se pela intensificação do grau de fibrosamento, proliferação fiblástica e angioblástica. Neste período foi evidente o maior número de CGMIs em torno do amterial do grupo III-1000.
Período de 30 dias
No grupo controle, notou-se maior fibrosamento, além da presença de inúmeros capilares sanguíneos. O infiltrado inflamatório crônico era discreto, porém existiam ainda alguns focos contendo macrófagos como nos períodos anteriores. No grupo II-100, o grau de fibrosamento aumentou em relação ao período anterior e algumas partículas de enxerto já estavam circunscritas por fibras colágenas bem mais organizadas. Nos animais do gruop III-1000, comparativamente ao período de 20 dias, notou-se aumento significativo no grau de fibrosamento, bem como no número de células inflamatórias envolvendo as partículas implantadas. Em comparação com o grupo II-100, o fibrosamento e a presença de CGMIs eram maiores no grupo III-1000.
Período de 60 dias
Células inflamatórias mononucleadas foram encontradas em alguns pequenos focos e o tecido de granulação, rico em vasos sanguíneos e fibroblastos, era discreto no grupo controle (figura 1B). Neste período, as partículas do grupo III-1000 apresentavam-se circunscritas ora por fibras colágenas bem organizadas, ora por CGMIs e alguns macrófagos (figura 1D). Já no grupo II-100 foram observados feixes maiores de fibras colágenas circunscrevendo as partículas implantadas e inúmeros capilares sanguíneos neoformados. Ainda neste período observamos inúmeras células gigantes multinucleadas no grupo III-1000 (figura 1F).
DISCUSSÃO
O osso mineral produzido a partir de osso bovino é uma hidroxiapatita natural, microporosa, cujo similar nos Estados Unidos está aprovado pela Food and Drug Administration para uso clínico como material ósseo-substituto de preenchimen-(6). Contudo, os mecanismos moleculares e celulares da resposta biológica a esse tipo de biomaterial não são completamente conhecidos.
A degradação do material e a remodelação dos tecidos demandam a participação de hidrolases, proteases, entre outras enzimas, bem como de estímulo para a divisão celular, de modo a reparar o tecido.
As fosfatases ácidas são hidrolases envolvidas em diversos processos como: reabsorção óssea (TRAP) controle do ciclo celular (Tyr-P) e digestão intracelular (FAL). Em função da complexidade das respostas celulares aos mais diferentes estímulos, muitas vezes é difícil determinar a função exata de certas enzimas nos diferentes processos fisiopatológicos. Porém, nossos resultados mostram claramente que a atividade das fosfatases ácidas varia durante o reparo e em função dos materiais implantados. A fase inicial, marcada por infiltrado inflamatório agudo, exibe maior atividade da FAL nos grupos experimentais do que no controle, sendo esta menor para o grupo III em relação ao grupo II; isso evidencia claramente a resposta mais acentuada no material tratado a 100ºC.
A atividade da FABMr está inversamente associada ao controle negativo do ciclo celular. A menor AE nos grupos II e III em relação ao controle sugere maior atividade proliferativa nos grupos experimentais, coincidente com a proliferação fibroblástica e angioblástica, observada histologicamente nos períodos de 20 a 60 dias. A AE da FBMr no grupo III foi menor do que a do grupo II, sugerindo que o osso bovino tratado a 1.000°C exerça maior estímulo sobre a proliferação celular e vascular.
A implantação subcutânea ou intramuscular de matriz óssea desvitalizada e desmineralizada pode induzir a osteogênese ectópica no local(13,14). Porém, a implantação de matriz óssea desvitalizada e mineralizada inibiria essa capacidade indutiva(13). Reddi e Huggins(14) (1972) identificaram células gigantes multinucleadas, ricas em ácidos orgânicos, presumivelmente para dissolução mineral, no sítio de implantação da matriz mineralizada. Foi proposto que a presença de matriz mineralizada, sozinha ou em combinação com matriz desmineralizada, inibiria a osteogênese ectópica. A natureza das células gigantes multinucleadas inflamatórias (CGMIs), recrutadas nos enxertos subcutâneos de partículas mineralizadas, ainda é motivo de controvérsia na literatura. Kelly e Schnei-(15) (1991) implantaram matriz óssea desmineralizada, mineralizada e a combinação de ambas, na região subcutânea dorsal de ratos adultos jovens. Eles verificaram nos implantes mineralizados a presença de CGMIs que não possuíam atividade fosfatase tartarato resistente (TRAP), nem morfologia similar à dos osteoclastos. No implante de matriz desmineralizada, a maioria das CGMIs demonstrou expressão significativa da TRAP e morfologia similar à de osteoclastos, enquanto que a implantação combinada dos materiais proporcionou a presença desses dois tipos de CGMIs.
No presente estudo, utilizando microscopia óptica, as características morfológicas das células multinucleadas observadas são muito sugestivas de uma reação tipo corpo estranho normal, contendo células gigantes(16,17). Não foram observados indícios de borda em escova nas CGMIs em volta do osso desproteinizado a 1.000°C implantados, em qualquer período experimental que exibia aparente regularidade de contorno das partículas. Contudo, em algumas regiões do osso tratado a 100°C observou-se na interface CGMIs-biomaterial imagem compatível com degradação do material.
O implante do osso mineral macrogranular na região subcutânea induziu um granuloma tipo corpo estranho, geralmente desencadeado por partículas inertes que atraem macrófagos, mas incapazes de ativar o sistema imune(18). Neste trabalho provavelmente isso tenha ocorrido devido a que a eliminação da parte orgânica protéica do osso bovino conferiu ao material uma propriedade físico-química semelhante à de uma partícula inerte, sem interação específica com as células de defesa da linhagem macrofágica atraídas para o local.
A ausência de maior ativação dos macrófagos pelas partículas de osso bovino macrogranular desproteinizado, tanto a 100°C como a 1.000°C, pode ser confirmada pelo aumento temporal do fibrosamento entre as partículas e pela normalização da atividade da FAT entre 10 e 60 dias pós-implantação. Recentemente, Oliveira et al(19) (1999) demonstraram, bioquímica e histologicamente, que a temperatura de desproteinização do osso cortical bovino não afetou a resposta celular quando implantado em subcutâneo de ratos, confirmando a biocompatibilidade do osso bovino inorgânico.
No presente trabalho, os dois materiais de osso bovino, produzidos em diferentes temperaturas de desproteinização, proporcionaram uma resposta tecidual no subcutâneo de ratos similar àquela descrita na literatura para o enxerto alógeno mineralizado nas mesmas condições, sugerindo que o osso bovino tenha potencial para ser testado como material ósseosubstituto de preenchimento(15), lembrando que, por se tratar de um material mineral sem a presença da parte orgânica, não apresenta potencial osteogênico e osteoindutor. Outras características do material, como resistência mecânica, deverão, ainda, ser investigadas. As diferenças quanto à composição do tecido reacional em contato com os dois tipos de materiais (menor resposta inflamatória nos períodos iniciais, maior numero de CGMIs e maior grau de fibrosamento no grupo III1000) parecem ser influenciadas pela temperatura de tratamento, já que o material tratado a 100ºC provavelmente preservou um componente protéico significativo (as características tintoriais semelhantes às da matriz orgânica óssea), enquanto o outro material, por ser exclusivamente composto da parte mineral do osso, esteve sempre cercado por diversas CGMIs, em todos os períodos experimentais. A preservação de parte do componente orgânico no material tratado a 100ºC pode ter sido a responsável pela indução de tecido reacional composto, em sua maioria, por macrófagos e por menor fibrosamento final que o do grupo III-1000. Neste último grupo, foi vista durante todos os períodos avaliados a presença de um fino pontilhado eosinofílico no local ocupado pelas partículas, sugerindo que proteínas plasmáticas, do animal, poderiam ter-se adsorvido durante o período em que o material estava implantado no seu tecido subcutâneo. Apesar das diferenças no tecido reacional, nenhum deles apresentou resposta imune, áreas de necrose, formação de pus ou atipias celulares.
CONCLUSÕES
Os resultados descritos aqui permitem concluir que os materiais testados são biocompatíveis nas condições testadas, sendo que o osso cortical bovino desproteinizado a 1.000°C (Gen-Ox) proporcionou resultados mais favoráveis em relação ao desproteinizado a 100°C, tanto na análise histológica como enzimática, possivelmente devido à desproteinização mais eficiente. Destarte, estes resultados estimulam a continuidade das análises mecânicas e biológicas dos materiais com vistas a avaliar sua possível aplicação na clínica médica como material de osteocondução.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos servidores da FOB-USP Ovídio dos Santos Sobrinho, Gilmar Vicente da Silva, Luiz Carlos da Silva, Erasmo Gonçalves da Silva e Daniele Santi Ceolin, pelo auxílio técnico prestado durante a execução deste trabalho.
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