EFEITO DA CALCITONINA NA INTEGRAÇÃO DA MATRIZ ÓSSEA BOVINA DESVITALIZADA, EM RATOS

O reparo de grandes defeitos ósseos continua sendo um desafio aos profissionais da área ortopédica e odontológica(1). Os métodos tradicionais de tratamento utilizam enxerto ósseo autólogo devido a sua superior capacidade osteogênica, facilidade de incorporação e ausência dos problemas imunológicos relacionados com os enxertos homólogos não autógenos e heterólogos(2,3,4,5). Entretanto, a sua utilização não é destituída de problemas; a aquisição de enxerto ósseo autógeno agrega riscos ao paciente, incluindo incisão cirúrgica adicional, aumento da morbidade pós-operatória e enfraquecimento do local doador. Além disso, ocorrem circunstâncias nas quais a quantidade de enxerto autólogo disponível é insatisfatória, como nas crianças e nos adultos submetidos a procedimentos operatórios anteriores(3,6,7,8,9).

Os biomateriais inorgânicos, uma alternativa ao uso de enxertos ósseos autólogos, possuem propriedades potencialmente semelhantes às do tecido receptor(3,10,11,12,13) e, quando usados em defeitos de ossos longos, constituem-se em obstáculo à invasão do tecido mole circunjacente, mantendo um ambiente rico em células osteogênicas dentro do defeito, permitindo crescimento de tecido ósseo diretamente sobre suas trabéculas porosas e acelulares(3,5,7).

Entre os biomateriais, a matriz inorgânica derivada de osso bovino é uma opção para preenchimento de cavidades por ser adaptável à irregularidade do local de implante, permitindo boa justaposição óssea, ser absorvível, ter facilidade de obtenção e baixo custo de produção, poder ser esterilizada e ser estocada em temperatura ambiente(14,15,16). É uma hidroxiapatita xenogênica, microporosa e natural(15,17,18). Funciona como arcabouço para neoformação óssea, podendo ser parcial ou completamente removida do local receptor, por um lento processo de reabsorção de superfície, desencadeando intensa reação inflamatória(16,19,20).

Todas as modalidades de enxerto estão sujeitas à influência de fatores inerentes ao organismo receptor, como a tensão de oxigênio, desnutrição protéica, doenças metabólicas, hormônios e vitaminas(21,22,23,24). A velocidade da reconstrução óssea está relacionada aos níveis de fósforo e cálcio do soro e de calcitonina, que, sendo um hormônio com ação direta no metabolismo desses minerais, constitui-se em fator de grande importância na recuperação e manutenção da homeostase ós-(21). Por possuir ação analgésica, antiinflamatória e antiosteoclástica, a calcitonina é utilizada no tratamento de distúrbios clínicos e biológicos caracterizados por excessiva remodelação óssea em humanos(25,26).

Ziegler e Delling relataram que o tratamento com calcitonina promove aceleração do processo regenerativo de defeito ósseo circunscrito, sem enxertia óssea, em ratos(27). Paavolainen et al não encontraram diferenças nos aspectos radiográficos, microscópicos e biomecânicos, em ratos submetidos a fratura tibial, com e sem uso de calcitonina(28). Guarniero et al estudaram a influência da calcitonina e da desnutrição protéica, isoladas e associadas, na resistência mecânica e na rigidez do tecido ósseo; observaram que a administração de calcitonina não compensou a diminuição da resistência e da rigidez óssea, mas reduziu a ocorrência de pseudartrose, em ratos(23). Canavero et al, utilizando calcitonina no reparo de defeitos ósseos circunscritos, em ratos, observaram formação de tecido de granulação infiltrado por células inflamatórias seguida por diferenciação osteoblástica e formação de trabéculas ósseas(29).

Considerando-se a possibilidade de a calcitonina promover aumento da atividade osteoblástica, fez-se estudo experimental morfológico comparativo do reparo de defeitos ósseos provocados em fêmur de ratos, preenchidos com matriz óssea bovina desvitalizada, utilizando-se calcitonina de salmão.

MÉTODOS
A proposta deste trabalho foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (37/2002) e todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Animal Experimentation Ethics Committee.

Foram utilizados 48 ratos Wistar, machos, adultos, com peso médio de 392 gramas (g), procedentes do Biotério Central da UFMS, distribuídos em dois grupos com 24 animais cada um: grupo experimento e grupo controle. Os animais foram anestesiados por solução 1:1 de xilazina (Rompun® - Bayer S.A. - 20 miligramas por mililitro (mg.mL-1)) e quetamina (Ketalar® - Parke, Davis & Co. - 50mg.mL-1), na dosagem de 0,1ml por 100g (mL.100g-1) de peso, por via intramuscular. Após tricotomia, foi realizada incisão longitudinal de 20 milímetros (mm) na face lateral da coxa, divulsão romba da musculatura com exposição da diáfise femoral, incisão e elevação periostal, confecção de defeito ósseo com broca metálica de 2mm de diâmetro acoplada em perfurador elétrico, interessando córtex lateral e medular óssea, em ambos os fêmures. Após preenchimento dos defeitos com matriz óssea bovina desvitalizada (Osteopur® - Homus Biotecnologia Com. Ind. Ltda.), fez-se reaproximação muscular com pontos simples de categute simples 3-0, sutura contínua da incisão cutânea com fio monofilamentado de poliamida 4-0, aplicação de 0,05mL (duas unidades internacionais) de calcitonina de salmão (Miacalcic® - Laboratório Novartis S.A.) nos animais do grupo experimento e de 0,05mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% nos animais do grupo controle, via intramuscular, no pós-operatório imediato.

Após recuperação anestésica foi permitido aos animais apoio imediato dos membros operados sem nenhum tipo de imobilização externa, sendo mantidos nas gaiolas, com água e ração à vontade até o cumprimento dos seguimentos de sete, 14 e 21 dias, quando oito animais de cada grupo foram pesados e sacrificados por inalação contínua de éter etílico.

Os fêmures foram dissecados e após análise macroscópica visando identificar alterações morfológicas da estrutura femoral - fratura, ossificação ectópica e persistência do defeito na cortical óssea - foram fixados em formol tamponado 10%, descalcificados e submetidos a processamento histológico rotineiro no Departamento de Anatomia Patológica Especial da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Cortes histológicos de quatro micra foram corados com hematoxilinaeosina e observados por microscopia óptica em relação à neoformação óssea. As fotomicrografias obtidas das lâminas histológicas foram submetidas à análise quantitativa do parâmetro acima mencionado utilizando-se software de análise de imagens (ImageLab 2.3). Os resultados foram submetidos à análise estatística pelos testes t de Student, Mann-Whitney e análise de variância por postos de Kruskal-Wallis para comparar os dois grupos de estudo em cada período (sete, 14 e 21 dias). O nível de rejeição da hipótese de nulidade foi fixado em 5% (a= 0,05).

RESULTADOS

Todos os animais ganharam peso (tabela 1) e não ocorreu nenhum óbito durante o experimento. Na análise macroscópica não foi observada a presença de fratura femoral nem de ossificação ectópica. O defeito na cortical óssea manteve-se visível em todos os períodos de seguimento.

Na microscopia óptica, as áreas do defeito em ambos grupos, com sete dias de seguimento, apresentavam-se preenchidas por fragmentos de matriz óssea bovina desvitalizada, estroma conjuntivo com neoformação vascular, ilhas de tecido ósseo neoformado e reação inflamatória com células gigantes multinucleadas em contato com a matriz óssea bovina e dispersas no infiltrado inflamatório. Maior concentração de osteoblastos e neoformação óssea (tabela 2) foi observada no grupo experimento (figura 1).

Com 14 dias, observaram-se fragmentos de matriz óssea bovina desvitalizada, estroma conjuntivo e presença de reação inflamatória em ambos os grupos (figura 2). No grupo controle observou-se tecido ósseo neoformado disposto em trabéculas delgadas, sem orientação espacial definida e com pouca ou nenhuma conexão com a superfície do osso receptor; no grupo experimento as trabéculas ósseas neoformadas eram longas e finas, orientadas em ângulo reto à superfície femoral e conectadas umas às outras por trabéculas paralelas à superfície do osso receptor.

Com 21 dias, em ambos os grupos havia presença de infiltrado inflamatório com poucas células gigantes multinucleadas, trabéculas ósseas densas com aspecto de osso lamelar e fragmentos de matriz óssea bovina envoltos por tecido ósseo neoformado. No grupo controle o canal medular mostrava-se maldefinido e com dimensões reduzidas; no grupo experimento houve completa reconstituição do espaço medular.

DISCUSSÃO

A correção de defeitos ósseos com perda de substância tem no enxerto ósseo autólogo o padrão ideal, mas sua utilização possui fatores limitantes, como a quantidade de material disponível em pacientes com baixa disponibilidade óssea autógena - crianças e idosos - ou com uso prévio desse estoque em procedimentos operatórios anteriores(30,31).

A regeneração óssea guiada por biomateriais facilita a formação óssea por proteção contra a invasão de tecidos nãoosteogênicos competidores(32,33). É com essa finalidade que as cavidades são preenchidas por matrizes orgânicas ou inorgânicas, que serão lentamente reabsorvidas e substituídas por osso neoformado(10,33). Entretanto, os diferentes materiais usa-dos também possuem limitações na sua aplicação, como a integração com o tecido receptor(1,34).

Entre os biomateriais disponíveis como substitutos ós-seos(34), a matriz óssea bovina desvitalizada foi selecionada neste trabalho experimental, para preenchimento das cavidades ósseas, por ser biocompatível, ter reserva de matéria-prima suficiente, ser de baixo custo e fácil manuseio, podendo ser estocada em temperatura ambiente e não exigindo instrumental cirúrgico especial para sua aplicação(1,16).

Como a osteogênese reparadora de defeitos ósseos, com ou sem uso de enxertia óssea, pode ser influenciada por fatores biológicos e físicos, promovendo aceleração ou retardando a reparação óssea, decidiu-se estudar as possíveis ações da calcitonina, em dose única, na integração da matriz óssea bovina desvitalizada em defeitos ósseos femorais provocados, operatoriamente, em ratos(35,36,37,38,39).

A calcitonina é um hormônio polipeptídico que participa ativamente da homeostase esquelética como regulador do metabolismo mineral e ósseo, interferindo na ação do paratormônio na manutenção da massa óssea(40,41).

A experimentação animal e os estudos clínicos mostraram que a calcitonina de salmão é a mais ativa das calcitoninas isoladas e absolutamente isenta de proteínas animais exógenas(25,40).

Por ser degradada pelos sucos gástricos, a calcitonina é administrada via subcutânea, retal, endovenosa, intramuscular ou nasal(40). Nesta pesquisa utilizou-se a calcitonina de salmão, via intramuscular, pela facilidade de aplicação da droga, melhor controle da dosagem e pela dificuldade de realizar a aplicação por via venosa ou nasal nos animais da amostra utilizada.

Com relação à dose de calcitonina, há divergências na literatura(23,27,28,29,40). Para este estudo utilizou-se em todos os animais a dose única de 2UI, via intramuscular.

Decidiu-se pela utilização da calcitonina, em dose única, no pós-operatório imediato porque, segundo Ito et al, a estimulação da formação óssea ocorre quando a calcitonina é administrada antes do início da osteogênese, provocando aumento no número de células osteoblásticas(41). Esse aspecto foi observado, com sete dias de seguimento, nos animais tratados com calcitonina, pela presença de maior concentração de osteoblastos, alinhados sobre as superfícies do tecido ósseo neoformado, enquanto nos animais não tratados com calcitonina a predominância era de osteoclastos (figura 1). Essas observações foram similares às relatadas por Ziegler e Del-ling e por Mantzavinos e Listgarten(27,42).

O rato foi escolhido como modelo animal pela facilidade de obtenção de amostra homogênea e simples manuseio. O ganho de peso apresentado por todos os animais da amostra (tabela 1) demonstra que os procedimentos operatórios realizados, o biomaterial utilizado e a droga injetada não interferem com o desenvolvimento normal do animal no período estudado.

A ausência de calcificações ectópicas na análise macroscópica demonstra que a matriz óssea bovina desvitalizada per-mite ajuste adequado ao defeito ósseo, sendo contido na cavidade pela cobertura muscular, sem necessidade de fixação adicional.

A identificação visual do defeito na cortical óssea, no período estudado, é explicada pela característica centrípeta da cicatrização de defeitos ósseos, ou seja, da periferia para o centro da cavidade, havendo inicialmente a formação e organização do hematoma por tecido de granulação, formação de tecido ósseo de padrão imaturo não lamelar; maturação das trabéculas ósseas, atividade osteoclástica e formação do estroma medular(1,20,21). Acredita-se que a ausência do acesso operatório cortical femoral tenha características tempo-depen-dentes, ou seja, que o período de seguimento utilizado neste trabalho experimental tenha sido insuficiente para a completa remodelação óssea cortical. Esses resultados foram similares aos relatados por Delling e Glueckselig em estudo de regeneração de defeitos corticais em tíbias de ratos(43).

A formação óssea para reparo de defeitos ósseos depende de adequado suprimento vascular e os osteoblastos exercem suas atividades apenas nas regiões adjacentes aos vasos san-guíneos(35). A redução de oxigênio parece alterar o código genético em direção ao tecido fibroso e fibrocartilagem, e a elaboração de tecido ósseo altamente organizado requer uma superfície mecanicamente estável, sendo o osso neoformado depositado em uma base sólida(33,44). Esse aspecto foi demonstrado na análise microscópica, em que, em todos os períodos de seguimento, houve neoformação de tecido ósseo, na sua grande maioria, justaposta às paredes do defeito e à superfície da matriz óssea bovina desvitalizada, que se mostrava basófila e com sinais de reabsorção, demonstrando ser ela um arcabouço biológico adequado para a neovascularização e deposição óssea (tabela 2).

Nos animais tratados com calcitonina, o aspecto histológico das áreas do defeito padrão, com sete dias de seguimento, demonstrou maior concentração de osteoblastos e formação de tecido osteóide, com trabéculas ósseas neoformadas exibindo numerosos osteoblastos alinhados em sua periferia, enquanto que, nos animais não tratados, o defeito ósseo mostrava-se preenchido por tecido conjuntivo bem vascularizado, rico em fibroblastos e células gigantes, com menor concentração de osteoblastos.

Nos animais tratados com calcitonina, com 14 dias de seguimento, as trabéculas ósseas mostraram-se inicialmente lon-gas e finas, orientadas em ângulo reto à superfície femoral e conectadas umas às outras por curtas trabéculas paralelas à superfície do osso, progredindo para trabéculas espessas e bem organizadas, enquanto que, nos animais não tratados com calcitonina, a maioria das trabéculas apresentava disposição em mosaico, algumas vezes, formando um ângulo agudo com a superfície do osso. Essa variação de arquitetura das trabéculas ósseas pode ter sido decorrente de maior estresse muscular resultante de mobilidade mais ativa dos membros opera-dos, em função da ação analgésica da calcitonina(25).

No seguimento de 21 dias, houve formação de medular óssea ampla e bem definida nos animais tratados com calcitonina, enquanto que, nos animais não tratados, a medular óssea mostrava aspecto indiferenciado e de dimensões mais reduzidas. Esses resultados foram semelhantes aos relatados por Sanchez et al e Pereira et al(33,40).

Com sete e 14 dias houve significância estatística na maior neoformação óssea, nos animais tratados com calcitonina (Z = 4,82 e Z = 4,43, respectivamente), porém, em seguimento de 21 dias, a presença de tecido ósseo neoformado foi semelhante e sem significância estatística em ambos os grupos (Z = 0,777). Esses resultados foram semelhantes aos relatados por Pereira et al e Delling e Glueckselig(40,43).

A reação inflamatória fisiológica é desencadeada em qualquer situação que exija cicatrização ou em que haja presença de materiais identificados pelo organismo como corpos estranhos. Na literatura existem relatos da intensa reação inflamatória desencadeada pela presença da matriz óssea bovina desvitalizada e de células gigantes multinucleadas, o que também foi demonstrado neste estudo(1,16,22,29,34,45,46).

Observou-se a presença de células gigantes multinucleadas no infiltrado inflamatório e nas circunjacências da matriz óssea bovina desvitalizada, sugerindo que esta estava sendo reabsorvida para posterior deposição óssea (figura 3). A contagem celular mostrou diferença estatisticamente significante nos animais tratados com calcitonina, nos períodos de seguimento de sete e 14 dias (Z = 4,48 e Z = 4,26, respectivamente), porém, aos 21 dias de seguimento, a contagem tornou-se semelhante e sem significância estatística (Z = 0,070) (tabela 3).

COMENTÁRIOS

O conjunto de resultados obtidos neste estudo experimental sugere que a ação da calcitonina faz-se mais evidente apenas nas fases iniciais da osteogênese reparadora estimulando a neoformação óssea, concordando com os resultados dos autores que relataram ser a efetividade do hormônio proporcional ao grau de turnover ósseo(47,48,49,50).

O real conceito sobre a atividade da calcitonina no reparo de defeitos ósseos preenchidos com biomaterial inorgânico absorvível ainda é limitado, sendo a comparação com dados da literatura dificultada pela diferença de metodologia, modelo experimental, dose empregada, via e tempo de administração da calcitonina, demandando estudos futuros para melhor definição de sua ação sobre as células componentes do tecido ósseo.

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