MATRIZ ÓSSEA HOMÓLOGA DESMINERALIZADA NA UNIÃO VERTEBRAL DORSOLATERAL LOMBAR EM COELHOS

A artrodese é procedimento eficiente no tratamento de condições traumáticas e de deformidade que acometem a coluna vertebral e que determinam sintomatologia dolorosa na região dorsal e nos membros pélvicos(1,2). Entretanto, a não-união varia entre 10 e 50% e o resultado é comprometido quando são obtidas quantidades insuficientes de osso para cobrir o leito receptor(2,3).

O conceito de materiais osteogênicos derivados de osso foi introduzido por Urist, ao postular que a matriz óssea contém proteínas morfogenéticas ósseas, expostas pela desmineralização, capazes de induzir a diferenciação de precursores pluripotentes da linhagem osteogênica(4,5).

A matriz óssea desmineralizada (MOD) pode ser utilizada com sucesso na artrodese vertebral em coelhos(6). Quando foi utilizada na indução da união dorsolateral lombar em ratos, demonstrou desenvolvimento de calo ósseo similar e de mesmo tempo de formação, que o desenvolvido a partir de enxerto ósseo autólogo(7). Ela possui potencial osteoindutor(8). Frenkel et al demonstraram, na artrodese vertebral em cães, que foi necessária menor quantidade de auto-enxerto ósseo quando ele foi associado à MOD(9).

Em cães, a MOD isolada ou em combinação com aloenxerto foi ineficaz na determinação de artrodese vertebral dorsolateral lombar estável(3). Radiograficamente, sítios de união tratados apenas com auto-enxerto ósseo ou associado a MOD apresentaram características similares ao final de 12 meses, apesar de o índice de união não ter sido determinado(10).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento da matriz óssea homóloga desmineralizada na promoção de união vertebral dorsolateral lombar em coelhos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 33 coelhos, machos e fêmeas, clinicamente sadios, adultos jovens (oito semanas), da raça Nova Zelândia Branca, com peso médio de 3kg, mantidos em gaiolas individuais no Biotério do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (UFV) e alimentados com ração comercial, feno e água.

Os animais foram separados aleatoriamente em dois grupos experimentais. O grupo 1 (G1) foi composto por 24 coelhos que receberam aloenxerto de matriz óssea desmineralizada sobre os processos transversos descorticados das vértebras lombares cinco e seis (L5 e L6), bilateralmente. O grupo 2 (G2) foi constituído de nove coelhos, cujos processos transversos das vértebras lombares (L5 e L6) foram descorticados bilateralmente. Objetivou-se relacionar descorticação e união vertebral por meio de análises histológica e radiográfica. Oito coelhos do G1 e três coelhos do G2 foram escolhidos de forma aleatória e submetidos à eutanásia às cinco, sete e nove semanas após os procedimentos cirúrgicos.

A matriz óssea desmineralizada foi coletada a partir da diáfise de fêmur de outros coelhos da mesma raça e porte, sacrificados com sobredosagem anestésica (tiopental sódico). Após a remoção de todo tecido mole, com auxílio de bisturi, as diáfises foram desmineralizadas por imersão em ácido hidroclorídrico 0,6N por 24 a 48 horas em temperatura ambiente. O ácido foi trocado a cada 24 horas e o osso foi considerado desmineralizado quando se apresentou flexível e transparente, sendo estocado em álcool 70% à temperatura ambiente. No momento da cirurgia os ossos foram cortados em seu eixo longitudinal e em segmentos de aproximadamente 0,5cm de largura por 2,0cm de comprimento.

Cada coelho recebeu como medicação pré-anestésica acepromazina (Acepram®), 0,1mg/kg por via intravenosa, seguida de anestesia dissociativa com tiletamina-zolazepam (Zoletil®), 20mg/kg por via intravenosa, associada à infiltração de anestésico local (lidocaína), na dose de 0,75ml, no local da incisão. Antibioticoterapia profilática foi realizada com ceftiofur sódico (Excenel®), 5mg/kg por via intramuscular, no período pré-operatório e 24 e 48 horas após o procedimento cirúrgico.

Os animais foram posicionados em decúbito ventral, com os membros pélvicos estendidos cranialmente e o procedimento iniciou-se com uma incisão de pele na linha média dorsal lombar, de aproximadamente 5cm de extensão, tendo como referência os processos espinhosos de L5 e L6. Bilateralmente, foi realizada uma incisão na fáscia paramediana após a aplicação de 0,5ml de lidocaína. Os músculos multífidus e longíssimos foram identificados e o plano entre eles foi divulsionado, permitindo a exposição dos processos transversos de L5 e L6 e da membrana intertransversa. Com o auxílio de um osteótomo, a face dorsal destes processos, de ambos os lados foi descorticada até que fosse visualizada a região óssea medular. Posteriormente, a MOD foi depositada sobre eles.

Após a realização dos procedimentos, a fáscia paramediana e o tecido subcutâneo foram suturados com categute cromado 4-0, com padrão de sutura do tipo Reverdin e a pele aproximada com fio de náilon 4-0, em sutura simples contínua. A analgesia pós-operatória foi obtida com morfina oral (Dimorf ®), 0,4mg/kg, a cada seis horas durante os três primeiros dias após o procedimento cirúrgico.

As avaliações radiográficas foram efetuadas na incidência dorsoventral, em todos os animais, imediatamente após o procedimento cirúrgico e à época da eutanásia. As análises foram baseadas na presença de massa óssea uni ou bilateralmente, caracterizando união a presença de massa óssea intertransversa bilateral sem radioluzência.

Após a eutanásia, a coluna vertebral lombar foi removida e os segmentos entre L5 e L6 de todos os animais foram palpados, assim como os segmentos adjacentes, proximal e distal, permitindo classificar os segmentos L5-L6 sólidos, firmes à movimentação, como união vertebral.

A avaliação histopatológica foi realizada em 12 animais do G1, quatro a cada época de eutanásia, e em nove animais do G2, três a cada eutanásia. Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson. A massa de união sobre os espaços interlaminares foi o segmento de maior interesse e foi analisada com base no tipo de tecido predominante.

A avaliação da resistência à tração foi realizada em 12 animais do G1, quatro a cada semana de sacrifício, escolhidos de forma aleatória. Imediatamente antes do teste, todo o tecido muscular remanescente, os discos intervertebrais e os processos articulares foram removidos com o auxílio de um bisturi, mantendo a massa de união e a membrana intertransversa conectadas às duas vértebras unidas. Posteriormente, os cor-pos vertebrais das vértebras L5 e L6 foram perfurados perpendicularmente com pinos de aço de 3,2mm de diâmetro e 12cm de comprimento, paralelos entre si; um sistema composto de correntes foi acoplado aos pinos (figura 1) e a carga foi aplicada seqüencial ao deslocamento e seus valores registrados em newtons e milímetros, respectivamente.

O teste foi realizado no Laboratório de Papel e Celulose (LPC) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), utilizando um equipamento Instron modelo 4204, com sistema computadorizado de aquisição, análise e saída de dados, com distância entre garras de 100mm, velocidade de teste de 25mm/min e capacidade da cédula de garra de 1.000N.

As propriedades avaliadas no decorrer dos testes de tração foram: 1) força máxima ao ponto de ruptura, força necessária para romper totalmente o corpo de prova, expressa em newtons ou um de seus múltiplos; 2) força ao limite de elasticidade, força absorvida pelo corpo de prova no seu limite máximo de elasticidade, ou seja, até esta força ser aplicada ao corpo de prova ainda possui capacidade de retornar à sua estrutura original, sem sofrer deformação, expressa em newtons, e 3) rigidez, habilidade do corpo de prova em resistir às deformações em função das tensões aplicadas, expressas em N/cm.

Também foram calculados os índices de união: força máxima do tratado pela força máxima do controle; força ao limite de elasticidade do tratado pela força ao limite de elasticidade do controle e razão da rigidez do tratado pela rigidez do controle.

Os dados radiográficos para a presença de união nos dois grupos, assim como a avaliação por palpação, os resultados do teste de resistência biomecânica e os dados histológicos foram analisados de forma descritiva. Os resultados do teste de resistência à tração foram avaliados pelo teste t de Student, para comparação entre duas médias de amostras aleatórias independentes. Para a comparação entre as diferentes semanas, as análises não foram pareadas, pois tratava-se de animais diferentes. Já a análise entre as vértebras tratadas e as adjacentes foram pareadas. Para todas as variáveis estudadas o grau de significância foi de 5% (p < 0,05).

RESULTADOS

Todos os animais toleraram bem o procedimento cirúrgico, iniciando movimentos de deambulação imediatamente após a recuperação anestésica e locomovendo-se normalmente no dia seguinte ao da cirurgia. Todas as feridas cirúrgicas cura-ram-se sem complicações ou sinais de infecção. A morbidade pós-operatória foi de 15,15% (cinco em 33 animais): um animal morreu devido a complicações anestésicas; um animal morreu dois dias após a cirurgia de causa não determinada e três animais apresentaram, ao momento de eutanásia, abscesso unilateral não envolvendo a massa de fusão e sem sinal sistêmico de infecção e não foram excluídos, portanto, do experimento.

À palpação, os segmentos não unidos, adjacentes ao operado, apresentaram mobilidade semelhante em ambos os grupos e em todos os momentos de avaliação, às cinco, sete e nove semanas. No G1, dos oito animais avaliados na quinta semana, apenas três apresentaram artrodese (37,5%) e às sete e nove semanas a união estava presente em 50% dos coelhos (tabela 1).

Na avaliação radiográfica do G1, na quinta semana, dois animais dos oito avaliados (25%) apresentaram radiopacidade na área de enxertia, unindo dois processos transversos bilateralmente. Na sétima semana todos os oito animais apresentaram pseudartrose e na nona, dois (25%) apresentaram evidências de união óssea (figura 5). No G2, nos três momentos avaliados havia discreta reação periosteal sobre os processos transversos, que também foi observada microscopicamente.

Na análise histológica do G1, às cinco semanas, foi possível observar a matriz fragmentada em quase sua totalidade, demonstrando sinais de fagocitose com algumas porções penetradas por vasos sanguíneos e presença de infiltrado inflamatório asséptico (figura 2), a MOD atuando como corpo estranho. A maioria dos vasos sanguíneos que penetrava o enxerto o fez a partir dos processos transversos descorticados.

Às sete semanas, foi observada integração entre os processos descorticados e a matriz e nesta interface foi observada a penetração de vasos sanguíneos, a presença de tecido cartilaginoso (figura 3A) e formação osteocondral na MOD. Porém, o restante da matriz continuou a ser fagocitada e substituída predominantemente por tecido conjuntivo fibroso (figura 3B).

Às nove semanas, a MOD foi observada em raras ocasiões. Presença de tecido cartilaginoso juntamente com tecido ósseo imaturo e trabéculas ósseas foram encontradas predominantemente na interface dos processos transversos com a matriz. Esta evolução se deu a partir dos processos transversos descorticados em direção e penetrando a MOD e aos processos adjacentes, tendendo a formar uma fina ponte óssea.

Os resultados do teste de tração para a força máxima ao ponto de ruptura, a força ao limite de elasticidade e o índice de rigidez demonstraram uma diferença significativa entre as vértebras tratadas com MOD e as vértebras adjacentes. Porém, dentre as semanas analisadas, essa diferença não foi significativa (tabela 2).

DISCUSSÃO

Os resultados apresentados neste experimento não ultrapassaram um índice de união vertebral de 50%, à semelhança do encontrado por Jorgenson et al(11). Esses autores, considerando o alto índice de pseudartrose, demonstraram que a MOD, isoladamente, não foi efetiva como único substituto para o auto-enxerto, que apresenta índices de não-união que variam de 10 a 50%(2,3,12).

Um dos fatores que comprometeram o sucesso da união foi a movimentação excessiva dos segmentos operados(13). Por essa razão, foi sugerido por Feighan et al que procedimentos com fixações rígidas promoveriam maior união(1). Para Mc-Naulty et al, a fixação interna não aumentou a taxa de união ou a sua resistência(14). Como o presente trabalho não tinha por objetivo avaliar qualquer tipo de fixação, não foi possível tal comparação. Entretanto, ficou evidente que a MOD preservou o espaço potencial para o tecido de união, prevenindo ossificação heterotópica e atuou como agente osteocondutor, como citado na literatura(9,15,16,17).

Histologicamente, os dados observados foram semelhantes aos de Kalfas, que descreveu como desvantagens da MOD a lenta formação óssea, reabsorção acelerada e incorporação tardia ou incompleta(16). Esses dados, de forma geral, justificam a alta incidência de pseudartrose ou união tardia.

Conforme observado por Frenkel et al, a vascularização para a região do enxerto, que progrediu a partir dos processos transversos descorticados, estimulou a união vertebral, num processo que se originou na interface enxerto/osso com ossificação endocondral, gradativamente penetrando e substituindo a matriz reabsorvida(9).

De acordo com Maddox et al, a utilização da MOD em pó apresentou variabilidade nas propriedades osteocondutoras e osteoindutoras. Eles postularam que as pequenas partículas determinaram melhores resultados, pois facilitaram a penetração de novos vasos sanguíneos(18). A MOD utilizada nesta pesquisa, sob a forma de segmentos, não foi empecilho à penetração vascular, pois, às cinco semanas, foi evidenciada a presença de vasos sanguíneos distribuídos pelo enxerto (figura 4).

Os resultados histológicos demonstraram áreas de fragmentação e mínima formação óssea a partir dos processos descorticados, com reabsorção da matriz até a nona semana e substituição por tecido conjuntivo fibroso. Esses achados divergiram do encontrado por Oikarinen, que afirmou que a MOD foi bem aceita pelo hospedeiro sem observação de partículas segmentadas e células do tipo inflamatórias(6). Por outro lado, Guizzardi et al afirmaram que a quantidade de bone morphogenetic prosthesis (BMP) liberada na desmineralização não é suficiente para intensificar a formação óssea na coluna vertebral(7).

A MOD agiu como um arcabouço passivo para o crescimento vascular e deposição óssea, o que também foi demonstrado pelo presente estudo(15). Os resultados das análises histológicas também foram semelhantes aos de Cook et al, que observaram reabsorção da matriz até 26 semanas após a cirurgia, sugerindo que, nesse ambiente, a MOD atuou predominantemente como agente osteocondutor e não osteoindutor(3).

Diversos estudos comprovaram a eficácia osteoindutora da MOD em falhas de ossos longos em humanos e animais(5,19,20). Nessa situação, a osteoindução pode ser efetiva pela proximidade com o amplo canal medular, que, por sua vez, possui células osteoprogenitoras, diminuindo a necessidade de migração destas células de locais distantes para o da enxertia. Porém, quando se trata de união vertebral, o microambiente e a biomecânica local são distintos e a descorticação do processo transverso, apesar de colocar a medula óssea em contato com o enxerto, o faz em quantidade reduzida. Ficou evidente, nas proximidades da região medular dos processos descorticados com a MOD, a presença de ossificação endocondral no local de interface entre o enxerto e osso (figura 6A).

Os resultados histológicos podem explicar a divergência entre os resultados da palpação e da análise radiográfica. Houve casos em que animais radiograficamente foram considerados "não-união", mas à palpação a área de enxertia se encontrava firme e sem mobilidade, sendo considerados "união". Essas áreas radioluzentes representavam, à microscopia, ilhas de cartilagem.

A determinação da força máxima ao limite de elasticidade consiste em um dado de maior relevância clínica do que aquele referente à força máxima ao ponto de ruptura, uma vez que não é preciso que ocorra a ruptura total da massa óssea para causar a instabilidade da coluna vertebral. O teste de tração demonstrou que as vértebras tratadas com a MOD apresentaram maior força máxima e força ao limite de elasticidade quando comparadas com as vértebras adjacentes (tabela 2). Contudo, não houve diferença significativa entre as semanas analisadas.

O índice de rigidez também demonstrou diferença significativa entre os segmentos tratados e adjacentes. Isso significa que as vértebras que receberam a matriz óssea desmineralizada suportaram uma determinada força e deformaram-se me-nos que as vértebras adjacentes submetidas à mesma força. Para a coluna vertebral que está submetida a forças deformantes constantemente, quanto maior o índice de rigidez da massa óssea, maior a estabilidade do segmento da coluna vertebral.

A média das propriedades mecânicas do sítio de fusão a cada semana (tabela 2) foi determinada com base nos valores de índice de união de cada animal. Cada média, em relação à força ao ponto de ruptura, força ao limite de elasticidade e ao índice de rigidez, que apresenta seu valor menor ou igual a 1, indica que não houve ganho ou aumento da resistência deste material, ao contrário daqueles que obtiveram valores maiores que 1. No total, em todas as semanas, os segmentos tratados mostraram maior resistência à tração quando comparados com os segmentos não tratados, o que pode ser imputado à predominância de tecido conjuntivo e ósseo presente sobre e entre os processos transversos dos segmentos tratados.

Em 1995, Boden et al utilizaram protocolo semelhante ao que empregamos para o teste de tração, porém, avaliando o auto-enxerto da crista ilíaca(12). Comparando os resultados de força ao ponto de ruptura encontrados por aqueles autores com os do presente estudo, ambos foram numericamente semelhantes, mas o índice de união encontrado por eles foi superior. Essa semelhança somente numérica pode ser justificada pela predominância de tecido conjuntivo fibroso na região de enxertia, encontrada na maioria dos animais aqui tratados.

Infere-se que o tecido conjuntivo fibroso, formado sobre os processos transversos descorticados das vértebras lombares cinco e seis (L5 e L6), bilateralmente, nos coelhos operados, apresentou capacidade de sofrer maior força deformante e não romper totalmente quando comparado com o tecido ósseo. Mas do ponto de vista clínico, o tecido conjuntivo formado, apesar de resistente, não foi capaz de manter a imobilidade do segmento da coluna vertebral, não promovendo união vertebral estável.

CONCLUSÃO

Evidências radiográficas, mecânicas e histológicas demonstraram que a matriz óssea homóloga desmineralizada de coelhos é ineficaz, quando utilizada isoladamente, na determinação de união vertebral dorsolateral lombar estável nestes animais.

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