Grandes avanços foram conseguidos no tratamento das lesões graves dos nervos periféricos devido ao maior conhecimento sobre sua fisiologia e ao desenvolvimento de técnicas como a microcirurgia. Entretanto, ainda assim, muitos casos não evoluem satisfatoriamente.
A busca do aperfeiçoamento das técnicas de reconstrução indica que a união cruzada de fascículos motores com sensitivos é uma das possíveis falhas nas reconstruções dos nervos periféricos. Quando uma fibra motora completar o processo de regeneração através de uma fibra sensitiva, ela não será capaz de atingir seu órgão efetor.
O mapeamento fascicular, que consiste na identificação das fibras predominantes de um fascículo, é a solução para que não ocorra mais esse tipo de sutura cruzada.
Alguns métodos podem ser utilizados para que esse mapeamento possa ser obtido durante o ato cirúrgico.
A primeira forma de mapeamento descrita foi a dissecção anatômica. Sunderland(21), em 1945, realiza minucioso trabalho de dissecção dos nervos radial, mediano e ulnal, procurando estabelecer parâmetros para a realização de suturas as mais precisas possíveis. A partir dos resultados dessas dissecções, elabora modelo para a distribuição espacial dos fascículos.
Os trajetos desses fascículos ao longo dos nervos é tortuoso e, por isso, quando ocorre a perda de um segmento de um nervo, mesmo que o tamanho da perda seja igual a um milímetro, não haverá correspondência entre os fascículos do coto proximal e do distal.
Autores como Jabaley & col.(12) e Terzis & col.(23,24), utilizando técnicas mais avançadas, elaboram modelos semelhantes ao de Sunderland, com a distribuição plexiforme dos fascículos. Esses autores, entretanto, consideram que os grupos fasciculares mantêm trajeto razoavelmente constante, permitindo que pudessem ser aproximados nas reconstruções.
Outra forma descrita de mapeamento fascicular é a estimulação elétrica direta dos fascículos no ato operatório. Em 1968, Hakstian(10) descreve método para realizar a diferenciação fascicular sensitiva e motora através desse método. O paciente consciente sob anestesia local deve informar ao cirurgião quando sente o estímulo dado sobre um fascículo sensitivo. O mapeamento dos fascículos motores no coto distal é obtido através do estímulo e anotação dos músculos que se contraem. A união é feita após obter-se o mapeamento dos dois cotos. A dificuldade desse método é a necessidade da colaboração do paciente, que é submetido a estímulos dolorosos e desagradáveis; além disso, está restrito às lesões agudas que podem ser operadas com anestesia local, impossibilitando o tratamento das de regiões proximais, como o plexo braquial.
Os métodos histoquímicos representam a terceira forma de realizar-se o mapeamento fascicular. Nesses métodos é pesquisada a presença de alguma enzima. Nas fibras sensitivas, a enzima pesquisada é a anidrase carbônica. Autores como Korhonen(15), Riley(17,18), Wong(25), Carson(1) e Terzis(22,23) descrevem trabalhos padronizando o método para que se possa detectar a presença da enzima no ato intra-operatório. O método encontra algumas limitações para sua aplicação prática. Uma dessas é o tempo decorrido entre a lesão e a realização da cirurgia, se este intervalo for maior que quatro dias.
Nas fibras motoras podem pesquisar-se a acetilcolina-trans-ferase e a acetilcolinesterase, que são enzimas antagônicas na transformação de acetilcolina em colina, como pode verse no quadro 1.
Engel & col.(3), Ganel & col.(5,6), Iwai & col.(11),Yajima & (26) trabalham na pesquisa de acetiltransferase. O método utilizado por esses autores é o radioimunoensaio, com a dosagem quantitativa da enzima em determinado tecido. Como o mapeamento necessita de precisão maior sobre quais fascículos ou grupos fasciculares devem ser reunidos, a pesquisa dessa enzima apresenta desvantagens.
O método histoquímico que pesquisa a presença de acetilcolinesterase nas fibras motoras é baseado no trabalho de Karnovsky & Roots(14), de 1964. Os autores descreveram uma coloração na qual as lâminas permanecem em imersão por cerca de 24 horas para que a enzima possa ser corada. Gruber descreve reconstruções baseadas em mapeamentos realizados por esse método. No primeiro tempo, o cirurgião retirava um fragmento do nervo proximal e outro do distal. Esses fragmentos são corados pelo método e, no dia seguinte, com o mapeamento dos dois cotos, realiza a sutura dos fascículos. Yunshao(27), Kanaya(13) e Deutinger(2) continuam as pesquisas com esse tipo de coloração. Novas soluções são obtidas, com diminuição do tempo de imersão dos fragmentos, tornando viável a utilização do mapeamento fascicular no intra-operatório de reconstrução dos nervos periféricos.
Uma limitação importante do método é que o mapeamento no coto distal nem sempre é conseguido. A causa provável é o desaparecimento da acetilcolinesterase do coto distal do nervo pelo processo de degeneração walleriana. Entretanto, não existem na literatura pesquisada relatos sobre qual é o período após a lesão em que o coto distal pode ser corado, permitindo o mapeamento fascicular.
Motivados por essa indagação e acreditando que esse método possa contribuir de alguma forma para a reconstrução dos nervos periféricos, procuramos estabelecer um modelo experimental que possa reproduzir, em nosso meio, a coloração histoquímica de fibras motoras baseada na atividade da acetilcolinesterase, com tempo de imersão compatível com sua utilização no intra-operatório de cirurgia de reconstrução de nervos periféricos. E, uma vez estabelecido o modelo experimental, procurar determinar o período após a lesão do nervo no qual é possível mapear o coto distal, através de relação entre as fibras coradas no coto distal e no coto proximal, considerando o tempo decorrido de lesão.
MATERIAL E MÉTODO
Material
No experimento, foram utilizados seis ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 400 e 500 gramas.
Método
Técnica cirúrgica para retirada dos segmentos de nervo ciático.
Utilizamos um microscópio cirúrgico da marca Zeiss com aumento de dez vezes.
Os animais foram submetidos a anestesia com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dosagem de 40mg por quilograma de peso.
A incisão cirúrgica, de aproximadamente 3cm, foi feita na parte posterior da pata do animal, desde a coluna vertebral em direção ao joelho. O nervo ciático foi isolado a partir de sua emergência na incisura isquiática. Retiramos um segmento de nervo 5mm distal à emergência do nervo. Esse segmento tem 3mm de comprimento.
Os cotos dos nervos foram isolados de forma que não ficassem em contato direto, para evitar a possibilidade de regeneração do coto proximal através do distal.
Os segmentos de nervo retirados nesse primeiro procedimento, denominados controle, são congelados em duas eta-pas.
Na primeira etapa, os segmentos de nervo são imersos em mistura de N-hexano com nitrogênio líquido, imediatamente após sua retirada. Essa mistura permite congelamento inicial de -20ºC. Já na segunda etapa, o conjunto é imerso em nitrogênio líquido puro, congelando os segmentos de nervo a -70ºC.
Os segmentos de nervo foram cortados com a utilização de criostato American Optical, a -20ºC, na espessura de 20 micra e recolhidos em lâminas de vidro.
Utilizamos a coloração descrita por Kanaya & col.(13) em 1991. Essa solução contém 3,0mM de acetiltiocolina iodada (Laboratório Sigma, código A5751), tampão fosfato (pH = 6,5) 65,0mM, citrato de sódio 5,0mM, sulfato de cobre 3,0mM, ferricianeto de potássio 0,5mM e tetraisopropil-pi-rofosforamide (ISO-OMPA) (Laboratório Sigma) 0,6mM.
As lâminas, depois de permanecer no banho da solução por 60 minutos, em temperatura de 45ºC, são lavadas e cora-das com azul de anilina. Posteriormente, as lâminas são desidratadas em banhos seqüenciais de álcool com concentrações crescentes do xilol e montadas com lamínulas de vidro com bálsamo do Canadá.
Todos esses procedimentos são repetidos no primeiro, terceiro, quinto e sétimo dias após a retirada do segmento controle, obtendo cinco lâminas de cada animal.
Contagem de fibras coradas
Realizamos a contagem de fibras coradas através da utilização de câmara de desenho (câmara clara - marca Nikon). Trata-se de dispositivo óptico que, acoplado ao microscópio, permite a visão simultânea do campo de leitura e de folha de anotações. Isso torna possível desenhar nas folhas de anotações tanto as fibras coradas como as não coradas, facilitando sua contagem e diminuindo a possibilidade de erro. As leituras das lâminas foram realizadas através de microscópio óptico Nikon, com aumento de 1.000 vezes em imersão.
As fibras com acetilcolinesterase são coradas em marrom escuro, enquanto as que não contêm essa enzima não apresentam coloração.
Nesse grupo também utilizamos a gratícula de integração de 100 pontos com área de 11.025µ2. Foram feitas leituras em 15 campos, totalizando 165.375µ2.
A partir do número de fibras coradas e não coradas em cada lâmina, calculamos um índice de fibras coradas. Este é o número de fibras coradas dividido pelo total de fibras encontradas em cada corte. Submetemos esses índices a análise estatística, obtendo média dos índices em cada dia. Essas médias foram submetidas a testes de regressão linear e quadrática, adotando-se um valor de R crítico correspondente a um p igual a ou menor que 0,05.
RESULTADOS
DISCUSSÃO
O mapeamento fascicular intraneural por dissecção ainda é o método mais utilizado. Envolve o conhecimento prévio, pelo cirurgião, da distribuição espacial dos grupos fasciculares dos principais nervos a serem reconstruídos. Entretanto, essas reconstruções não são específicas, como pode ser demonstrado pelos trabalhos de Sunderland(21), Jabaley(12) e Ter-(23), pois o trajeto espacial desses fascículos não é constante. Perdas segmentares de poucos milímetros fazem com que não ocorra correspondência entre os fascículos proximais e distais.
A estimulação elétrica tem várias desvantagens. Só pode ser utilizada nos nervos que têm lesões parciais. O mapeamento dos fascículos que conduzem estímulos de sensibilidade exige que a cirurgia seja realizada com anestesia local, com o paciente consciente, informando sobre esses estímulos.
Os métodos de mapeamento fascicular baseados nas atividades de enzimas dos nervos periféricos são o da anidrase carbônica, presente em fibras que conduzem estímulos de sensibilidade, e os da acetiltransferase e acetilcolinesterase, presentes nas que levam estímulos motores.
A coloração da anidrase carbônica descrita por Korhonen & col.(15) é utilizada por vários autores, dos quais destacamos Terzis & col.(24). Esses autores aplicam o método so-mente nos casos em que a lesão ocorreu menos de 48 horas antes da cirurgia.
O mapeamento baseado na acetiltransferase é um radioimunoensaio que determina a presença ou não da enzima. O mapeamento obtido através desse método é pouco específico, pois apenas detectamos se um grupo fascicular tem predomínio de fibras motoras. Estudos clínicos demonstraram a presença da enzima no coto distal quatro meses após a lesão, que nesses casos era parcial, havendo comunicação entre o axônio proximal e o estudado.
O mapeamento fascicular obtido através da coloração da acetilcolinesterase é método rápido, o que permite sua utilização intra-operatória, e preciso, pelo emprego de inibidores de enzimas inespecíficas. Em relação ao radioimunoensaio da acetiltransferase, é método mais específico. Até o momento, não há na literatura pesquisada relatos de experimentos específicos que determinassem até quanto tempo após a lesão do nervo o método pode ser utilizado.
A elaboração de modelo experimental que nos permitisse realizar o mapeamento fascicular através da coloração da acetilcolinesterase é o primeiro objetivo a ser alcançado neste trabalho.
A intenção deste experimento é estudar as características de um método que possa ser aplicado na prática clínica. Por isso, escolhemos o método descrito por Kanaya & col.(13), em 1991, que prevê banho no material histológico de cerca de 60 minutos, compatível com a utilização de cirurgia convencional de reconstrução microcirúrgica de nervos periféricos.
A formação de artefatos nos cortes histológicos produzidos no momento do congelamento do tecido foi um dos problemas verificados. No ensaio preliminar, utilizamos nitrogênio líquido e verificamos a formação desses artefatos, que atribuímos ao congelamento rápido.
Namba & col.(16), em 1967, utilizaram isopentano misturado ao nitrogênio líquido, atingindo temperatura cerca de -20ºC. Após esse congelamento intermediário, o espécime foi congelado em nitrogênio líquido, atingindo -70ºC.
Neste trabalho, adotamos o hexano, que tem propriedades químicas semelhantes às do isopentano, também proporcionando temperatura de congelamento intermediária. O hexano tem vantagens na sua manipulação, pois o isopentano é substância instável e sujeita a explosões.
Terminada essa fase de ensaio preliminar, passamos ao segundo objetivo do trabalho, que é a averiguação de quanto tempo após a lesão do nervo periférico é possível evidenciar a presença da acetilcolinesterase no coto distal.
A determinação do número de fibras coradas foi feita com a utilização de microscópio óptico acoplado a câmara clara, que permite a projeção da imagem em folha de papel, possibilitando o desenho tanto das fibras coradas como das não coradas. O diâmetro da secção do nervo periférico é variável conforme a região do corte. Para que pudéssemos uniformizar a área de leitura, determinamos uma área comum a todos os cortes que corresponde ao de 15 campos da gratícula de integração utilizada.
Realizamos cortes seqüenciais do nervo ciático do rato. O segmento retirado no primeiro dia funcionará como controle, pois o número de fibras contadas corresponde ao do coto proximal do nervo lesado.
O corte referente ao segmento retirado no primeiro dia corresponde ao coto distal de um nervo lesado um dia antes do exame realizado. Os cortes seqüenciais corresponderão a três, cinco e sete dias.
Estudos clínicos realizados por Kanaya e col.(13) mostram que nos cotos distais de nervos lesados submetidos ao método de coloração proposto só foi possível fazer o mapeamento em pacientes que apresentavam lesões no máximo cinco dias antes do procedimento. Por ser estudo clínico, não se pode determinar qual o período em que é possível evidenciar a presença da acetilcolinesterase nos cotos distais.
Conforme verificamos nos resultados do experimento, o número de fibras coradas caiu conforme aumentava o tempo decorrido da lesão. Conseqüentemente, o número de fibras não coradas aumentava, comprovando que as fibras motoras no coto distal têm essa enzima degradada (fig. 1).
Os experimentos realizados por Ganel & col.(5) evidenciam que a enzima acetiltransferase não pode ser detectada através de radioimunoensaio após o quarto dia de lesão. A acetiltransferase e a acetilcolinesterase são enzimas de funcionamento antagônico. Intuitivamente, acreditamos que a meiavida dessas duas enzimas no coto distal do nervo lesado deva ser semelhante. A comprovação através dos nossos resultados foi verificada.
Para uniformizar os dados, estabelecemos um índice de fibras coradas sobre o total de fibras encontradas em cada corte estudado. É o número de fibras coradas somado ao número de fibras não coradas, conforme a fórmula abaixo:
A queda do índice de fibras coradas mostra que a presença da acetilcolinesterase é cada vez menos detectável no decorrer do tempo pós-lesão. Ao realizarmos a análise estatística, pudemos determinar uma função linear representada graficamente na fig. 3 e que indica que no sétimo dia após a lesão o índice de fibras coradas é próximo de zero.
A partir desses achados, concluímos que, após o sétimo dia da lesão, não é possível diferenciar as fibras motoras das sensitivas no coto distal dos nervos ciáticos de ratos, através do método estudado. A utilização do método histoquímico para evidenciar a presença da acetilcolinesterase, portanto, possibilita o mapeamento do coto distal até sete dias após a lesão.
O mapeamento fascicular através da histoquímica enzimática da acetilcolinesterase está indicado como método auxiliar nas reconstruções de nervos periféricos recentes, isto é, que ocorreram há menos de sete dias da intervenção cirúrgica; o método será melhor aplicado se mais precocemente possível.
Nas lesões traumáticas do plexo braquial por tração, quando ocorre a lesão de raiz nervosa próxima à sua emergência da coluna cervical, sempre existe a dúvida sobre se esta poderá ser utilizada para a reconstrução dos nervos ou se ela foi avulsionada junto à medula espinal. Nesses casos, poderemos utilizar o mapeamento através da evidência acetilcolinesterase, pois em geral, nesses casos por avulsão, a indicação e a realização da exploração cirúrgica só são feitas após alguns meses decorridos da lesão. A presença de fibras com acetilcolinesterase indica que há continuidade dessas fibras com o seu corpo celular, podendo ser utilizada para a reconstrução da raiz nervosa.
Ainda nos casos de lesão do plexo braquial, existem situações em que é necessária a realização de neurotização extraplexual, isto é, a reconstrução de nervo lesado unindo o seu coto distal a nervo que terá sua função original sacrificada.
Uma das técnicas de neurotização é a utilização de alguns ramos dos nervos intercostais para a reconstrução da parte motora dos nervos musculocutâneo e mediano. A identificação do grupo de fascículos motores desses nervos intercostais facilitará a reconstrução dos nervos do membro superior lesado.
Existem técnicas de transplante autógeno vascularizado de músculos. Elas estão indicadas nos casos em que ocorre lesão muscular mas os nervos estão preservados. Como há necessidade de que o músculo transplantado faça contração, o ramo motor que o inerva deve ser neurotizado com um nervo motor do leito receptor. Acreditamos que o mapeamento fascicular possa ser utilizado nesses casos para facilitar a reinervação do músculo transplantado.
A utilização na prática clínica do método de mapeamento fascicular pode e deve ser ampliada, mesmo com a limitação do período no qual podemos realizar a diferenciação no coto distal das lesões dos nervos periféricos. Espera-se que a utilização deste método venha aprimorar o tratamento das lesões dos nervos periféricos.
CONCLUSÕES
É possível reproduzir um método de mapeamento fascicular de nervos periféricos baseado na histoquímica enzimática da acetilcolinesterase, com a duração compatível com sua utilização intra-operatória em reconstrução de nervos periféricos.
A histoquímica enzimática da acetilcolinesterase evidencia fibras coradas em nervos ciáticos até sete dias após a lesão, no seu coto distal.
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