A fosfatase alcalina contida no plasma humano é fisiologicamente a somatória de várias isoenzimas que provêm do osso, do fígado, do intestino e da placenta, durante a gravi-(5,7,10). Existem outras isoenzimas que, contudo, indicam condições patológicas. Estas são a isoenzima biliar, que aparece em casos de obstrução biliar, e a isoenzima Regan, que se detecta em 3% a 15% dos pacientes com câncer(5,7,20). A fosfatase alcalina óssea é marcador da atividade osteoblástica e o surgimento desta isoenzima coincide com a formação óssea(9). Além do mais, a detecção da fosfatase alcalina óssea pode indicar a presença de tecido ósseo derivado de condições patológicas malignas(21).
Diferentes métodos podem ser utilizados para reconhecer o órgão de origem das distintas isoenzimas de fosfatase alcalina presentes no soro ou plasma: inativação térmica(6,12,19), inibição por L-fenilanina(14), uréia(4), levamisol(1), homoargi-nina(11), eletroforese realizada com diversos suportes(13,15) e cromatografia de troca iônica(5). Estes métodos variam amplamente em custo e complexidade. Embora o método da inativação térmica seja simples e relativamente eficiente, não se encontram relatos de sua utilização na dosagem deste marcador laboratorial da atividade osteoblástica na literatura ortopédica.
Conscientes desse fato, apresenta-se metodologia de dosagem da fosfatase alcalina óssea exeqüível em qualquer laboratório de análises clínicas. Esta técnica baseia-se na termoinativação plasmática da fosfatase alcalina como método qualitativo, utilizando-se a reação de Roy(23) para sua quantificação. Além de discutir os aspectos relevantes do uso da dosagem desse marcador (especialmente em casos de sarcomas osteogênicos), os autores levam a cabo um ensaio laboratorial preliminar em 47 pacientes pré-selecionados, no sentido de comprovar a aplicabilidade desta metodologia.
CASUÍSTICA E MÉTODO
Foram selecionados para o estudo 47 pacientes entre um e 20 anos que compareceram a instituição hospitalar para exames de rotina, cujas fichas clínicas não continham evidências de patologias ósseas e/ou hepáticas. As amostras de sangue coletadas para essa finalidade foram também utilizadas para a dosagem da fosfatase alcalina. Esses pacientes somaram 28 do sexo masculino e 19 do feminino, não havendo diferenças estatisticamente significativas entre a distribuição por idade e/ou faixas etárias entre ambos os sexos (tabelas 1 e 2).
Todas as amostras analisadas estavam rigorosamente dentro da faixa de normalidade para suas respectivas idades, ou seja, para crianças até 12 anos aceitaram-se valores entre 56 e 156 e, para indivíduos acima de 12 anos, entre 13 e 43U/L.
As amostras de plasma heparinizadas eram imediatamente estocadas a -10ºC para evitar alterações nos resultados(6). A atividade da fosfatase alcalina era dosada em amostras de plasma heparinizado pelo método de Roy(23), utilizando-se como substrato o monofosfato de timolftalina. De cada amostra eram feitas duas dosagens: a primeira, após incubação a 37ºC durante dez minutos, fornecia a atividade total da fosfatase alcalina plasmática; a segunda, após incubação a 56ºC durante cinco minutos(6), fornecia a atividade de fosfatase alcalina plasmática termoestável. Os resultados foram obtidos em valores absolutos a 37ºC e em percentual da atividade da enzima após termoinativação, ou seja, dividindo-se a segunda dosagem pela primeira. Os valores absolutos dão idéia do nível total da atividade da fosfatase alcalina e os valores em percentual refletem a predominância da isoenzima óssea ou hepática. Para as condições de 56ºC durante cinco minutos, Cadeau & Malkin(6) estabeleceram que valores acima de 58% indicam predominância da fosfatase alcalina hepática e, abaixo de 50%, predominância de fosfatase alcalina óssea(6).
Realizou-se distribuição de freqüências absoluta e relativa dos valores nominais e estatística descritiva dos ordinais, média (M), desvio-padrão (DP), erro padrão da média (EPM), valores mínimos (Mín), valores máximos (Máx), e número de casos (N). Na comparação entre ocorrência de indivíduos masculinos e femininos segundo faixa etária utilizou-se o teste do qui-quadrado. Nas comparações entre amostras ordinais não paramétricas utilizou-se o teste U de Mann-Whit-ney com transformação z e na verificação de relação entre amostras ordinais, testes de correlação. Adotou-se o nível de significância de 5% (a = 0,05)(24).
RESULTADOS
Obteve-se média geral de 39,96% (DP = 16,50) de atividade de fosfatase alcalina após a termoinativação. As médias de fosfatase alcalina para o sexo masculino (39,13%) e feminino (41,12%) não diferiram significativamente entre si (tabela 3). Não foi possível observar correlação estatística entre a atividade remanescente de fosfatase alcalina e a ida-de dos indivíduos (tabela 4).
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Vários autores demonstraram que a fosfatase alcalina óssea é mais termolábil que a de origem hepática; é portanto, inativada mais rapidamente pelo calor(6,12,19,20). Baseadas nesse fato, várias técnicas de dosagem da atividade remanescente de fosfatase alcalina pós-tratamento térmico foram estudadas com êxito. O valor obtido pode ser expresso em percentual da atividade original e, quanto menor for este valor, maior será a proporção de fosfatase alcalina óssea contida na amostra(6,12,19,20).
A fosfatase alcalina de origem intestinal pouco interferiria no resultado, tendo em vista que está presente em apenas cerca de 25% dos soros, apresentando-se, contudo, em pequenas quantidades e mais provavelmente em indivíduos secretores pertencentes aos grupos sanguíneos B ou O(12,20). Cadeau & Malkin(6), em 1973, estabeleceram como forma de dosagem a temperatura de 56ºC durante cinco ou dez minutos, já que estes tempos não mostraram diferenças significativas nos seus resultados. Com o uso do tempo de cinco minutos, encontraram o valor médio de 49% (DP = 9) para 60 indivíduos adultos normais analisados. Estabeleceram também que valores acima de 58% indicam predominância da isoenzima hepática e, menores que 50%, predominância da isoenzima óssea.
Na presente casuística obteve-se o valor médio de 39,96% (DP = 16,50) para dosagens nas mesmas condições dos auto-res citados (56ºC durante cinco minutos)(6). Estes dados mos-tram que indivíduos entre um e 20 anos apresentam predomínio de fosfatase alcalina óssea maior que os adultos. Não foi possível relacionar os níveis obtidos com a idade dos pacientes (tabela 4). Contudo, ressalte-se que a amostragem e a casuística aqui apresentadas figuram como preliminares, servindo apenas para solidificar o método da termoinativação da fosfatase alcalina como eficiente, simples, rápido e exeqüível em laboratórios modestos, visto que utiliza um kit comercial já amplamente difundido nos laboratórios de análises clínicas, baseado na reação de Roy(23).
A fosfatase alcalina é parâmetro laboratorial largamente utilizado em ortopedia. Contudo, este antigo parâmetro ain-da não teve seu significado clínico completamente elucidado no curso da patologia tumoral óssea. A primeira dificuldade deriva do fato de que não há aceitação geral entre níveis altos desta enzima com o prognóstico da tumoração. A segunda diz respeito à falta de trabalhos na literatura que utilizem a isoenzima óssea da fosfatase alcalina na predição de tais lesões. Assim, há necessidade de se investigar antigas premissas da literatura ortopédica à luz da bioquímica mo-derna para reavaliar o verdadeiro papel dessa dosagem laboratorial.
Há muito se sabe que a fosfatase alcalina é o único parâmetro laboratorial que está significativamente elevado em pacientes portadores de sarcomas osteogênicos. Altos níveis foram relatados em 40% a 80% dos pacientes com osteossar-(17,18,25) e o aumento dos níveis enzimáticos foi relacionado com a atividade osteoblástica da célula tumoral.
McKenna & col.(18), em 1966, na análise de seus 258 casos de osteossarcomas clássicos relatam que, de 18 pacientes que sobreviveram a longo prazo e tiveram dosagens pré-operató-rias de fosfatase alcalina, três (16,7%) tinham níveis elevados e 15 (83,3%), normais. Após a cirurgia, esses três pacientes com níveis elevados voltaram a níveis séricos normais. Dos 115 que morreram às custas do osteossarcoma, 64 (55,6%) tinham valores de fosfatase alcalina normais préoperatoriamente, enquanto 51 (44,4%) apresentavam níveis elevados. Vinte e dois desses 51 tiveram dosagens pós-operatórias; 12 (54,5%) destes continuaram com valores elevados e dez retornaram a níveis normais. Além disso, dos 48 pacientes que apresentaram recorrência ou metástese, 79% tiveram elevados níveis séricos de fosfatase alcalina no surgimento desta complicação.
Em 1979, Thorpe & col. estudaram 30 pacientes com sarcomas osteogênicos. Dos 17 pacientes com níveis sérios de fosfatase alcalina pré-operatórios elevados, 12 (70,6%) apresentaram recidivas. Ao contrário, dos 13 pacientes com níveis normais, apenas quatro (30,8%) recidivaram. Correlação similar não foi observada com os níveis pós-operatórios dessa enzima.
Em 1992 e posteriormente em 1993, Bacci & col.(2,3) publicaram dois trabalhos que solidificaram tais achados e que somariam respectivamente 340 e 656 pacientes. Na primeira publicação(3) encontraram níveis de fosfatase alcalina elevados em 61,7% dos pacientes com doença localizada e em 87,6% com metastática. Entre os pacientes com níveis inicialmente normais de fosfatase alcalina, 77% estavam livres da doença em seguimento de cinco anos contra 22,5% que apresentaram recidiva. Entre os pacientes com níveis iniciais elevados, 59% estavam livres da doença por cinco anos contra 40,6% que apresentaram recidiva.
Na segunda publicação(2), os autores acharam fosfatase alcalina pré-tratamento elevada em 91,5% dos pacientes com doença metastática e em 61,3% com localizada. Entre os pacientes com níveis pré-tratamento normais, 26,45% recidivaram e 73,6% permaneceram sem recidivas em cinco anos. Entre os com níveis pré-tratamento elevados, 55,1% recidivaram e 44,8% permaneceram sem recidivas em cinco anos.
Esses dois(2,3) trabalhos ainda relatam que em torno de 71% dos tumores osteoblásticos tinham níveis aumentados de fosfatase alcalina pré-tratamento, contra 42,8%(2) a 53,7%(3) dos outros histótipos; o grau histológico do tumor não mostrou variação significante. Esses autores concluem, também, que os níveis pré-tratamento de fosfatase alcalina se correlacionam bem com o prognóstico da tumoração, embora os níveis pós-tratamento não apresentem essa mesma correlação.
Embora não seja aceitação geral(8), parece inquestionável que valores séricos da enzima fosfatase alcalina dosados no instante pré-tratamento estão estreitamente relacionados com o prognóstico de recidivas do tumor. É de se supor, então, que melhores conhecimentos a respeito do significado clínico desta enzima no curso da patologia óssea tumoral advirão da dosagem plasmática "em isolado" da isoenzima óssea, a única que realmente é produzida por célula osteoblástica em atividade.
No levantamento de literatura realizado, apenas em 1993 surgiu o primeiro trabalho nesta linha que utilizou a dosagem da fosfatase alcalina óssea como marcador da atividade osteoblástica. Nesse ano, Leung & col.(16) utilizaram método de precipitação seletiva com tríton X-100 e lectina para do-sar a isoenzima óssea em pacientes com osteossarcoma e concluíram que essa dosagem é mais específica e mais promissora que a fosfatase alcalina "total" no diagnóstico, prognóstico, avaliação do tratamento e na detecção de recidivas.
No presente relato, credita-se essa carência na literatura à dificuldade da dosagem laboratorial dessa enzima através de procedimentos ordinários de laboratório. O método da termoinativação aqui apresentado dá idéia clara da predominância da isoenzima óssea ou hepática, mostrando-se eficiente, simples, rápido e de baixo custo. Dessa forma, apresentase alternativa viável que poderá difundir mais rapidamente o uso da fosfatase alcalina óssea como marcador da atividade osteoblástica.
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